Міністерство аграрної політики та продовольства України

Міністерство аграрної політики та продовольства України

Львівський національний університет ветеринарної медицини та біотехнологій ім. С.З. Гжицького

Індивідуальне навчально-дослідне завдання на тему:

«Одержання генів»

Виконала:

Студентка ІІ курсу ФВМ

6 підгрупи

Панасюк Любов

Львів 2012

План

1. Виділення генів з природного матеріалу

2. Хімічний синтез генів

3. Ферментативний синтез генів

Використана література

Ген - структурна і функціональна одиниця спадковості, що контролює розвиток певної ознаки чи властивості. Сукупність генів батьки передають нащадкам під час розмноження.

На сьогодні встановлено, що гени - це ділянки ДНК, що несуть будь-яку цілісну інформацію - про будову однієї молекули білка або однієї молекули РНК. Ці та інші функціональні молекули визначають ріст і функціонування організму.

У той же час, кожен ген характеризується низкою специфічних регуляторних послідовностей ДНК, таких як промотори, які беруть безпосередню участь в регулюванні прояви гена. Регуляторні послідовності можуть перебувати як у безпосередній близькості від відкритої рамки зчитування, котра кодує білок, або початку послідовності РНК, як у випадку з промоторами (так звані cis-регуляторні елементи, англ. Cis-regulatoryelements), так і на відстані багатьох мільйонів пар основ (нуклеотидів), як у випадку з енхансерами, інсуляторами і супресорами (іноді класифікуються як trans-регуляторні елементи, англ. trans-regulatoryelements). Таким чином, поняття гена не обмежене тільки кодованою ділянкою ДНК, а являє собою більш широку концепцію, що включає в себе і регуляторні послідовності.

Спочатку термін ген з'явився як теоретична одиниця передачі дискретної спадкової інформації. Історія біології пам'ятає суперечки про те, які молекули можуть бути носіями спадкової інформації. Більшість дослідників вважали, що такими носіями можуть бути тільки білки, так як їх будова (20 амінокислот) дозволяє створити більше варіантів, ніж будова ДНК, яке складено всього з чотирьох видів нуклеотидів. Пізніше було експериментально доведено, що саме ДНК включає в себе спадкову інформацію, що було представлено у вигляді центральної догми молекулярної біології.

Можливість виділення окремих генів у складі відносно невеликих фрагментів ДНК була продемонстрована незадовго до виникнення генної інженерії в експериментах invitro. У 1969 р. Дж. Беквіт, Дж. Шапіро та інші опублікували роботу з виділення генів лактозногооперонаЕ.coli, засновану на поєднанні традиційних методів генетики мікроорганізмів і фізичних методів виділення і гібридизації молекул ДНК.

Методи одержання генів

Окремі гени з метою їх подальшого молекулярного клонування в складі рекомбінантних ДНК методами генної інженерії можуть бути отримані такими способами:

1) безпосереднім виділенням з природних джерел

2) шляхом хімічного синтезу;

3) копіюванням відповідної гену і РНК для отримання компліментарної ДНК-вої репліки (до ДНК).

Перший метод широко використовувався на ранньому етапі розвитку генної інженерії. Тотальну ДНК з різних джерел піддавали деградації різними рестріктазами, зшивали з векторними молекулами, вводили в реципієнтного клітини і відбирали клони з гібридними молекулами, що включали потрібний ген, по появі відповідних маркерів донора (наприклад, стійкості до певного антибіотику) або за допомогою спеціальних імунологічних та гібрідізаціонних методів. Цей метод не втратив свого значення і успішно застосовується, наприклад для створення банку генів.

Виділення генів з природного матеріалу

Суть методу – з клітин виділяють ДНК і фрагментують її ензимами для виділення генів.

• У 1972 році відкрили рестриктази.

• Рестрикційніендонуклеази (рестриктази) – це бактеріальні ензими, які розщеплюють ДНК яка потрапляє в бактеріальну клітину з вірусами (захисна дія). До 1985 року індентифікували 100 рестриктаз, сьогодні – близько 400.

• Дію рестриктаз нейтралізують метилази, які метилюють азотисті основи (рестриктази не розщеплюють метильовані сайти).

Рестриктази розщеплюють ДНК з утворенням двох типів кінців:

1. РестриктазаE.coRI (виділена з E.coli) специфічна до зв’язків А і Г. Вона розщеплює ДНК на фрагмети з одноланцюговимипослідовостями які є “липкими” кінцями.

2. РестриктазаHaeIII (виділена з Haemophilusaegypticus) специфічна до зв’язків Г і А. Вона розщеплює ДНК залишаючи “тупі” кінці.

Недоліки методу виділення генів з природного матеріалу:

• Важко точно “вирізати” ген з ДНК, тобто залишаються зайві нуклеотиди, які заважають наступному використанню генів, або може бути відсутня необхідна частина гена.

• Якщо ген дуже малий, то його складно виділити з отриманої суміші.

• Краще застосовувати для генів прокаріот, що не мають екзон-інтронної (в генів еукаріот) будови, яка ускладнює їх дію.

Штучний синтез гена вперше здійснено хімічним шляхом в 1969 р. групою Корани зі співробітниками. Хімічному синтезу генів істотно сприяло вдосконалення методів вивчення первинної структури білків або інших продуктів, що кодуються синтезується геном, а також методів визначення первинної структури (секвенування) нуклеїнових кислот. Секвенування ДНК відіграє велику роль не тільки в роботах по хімічному синтезу генів, але і при вивченні їх функції, їх регуляторних послідовностей, а також цілих генетичних систем, наприклад мобільних диспергованих генів у еукаріотів.

Аналіз первинної структури ДНК, тобто встановлення послідовності нуклеотидних залишків в її молекулі, в даний час заснований на двох методах - методі хімічної деградації (А. Максам і В. Гілберт, 1977) і метод полімеразної копіювання з використанням терминируются аналогів нуклеотидів (Ф. Сенгер, 1977).

Хімічний синтез генів

Суть методу: структуру гена встановлюють на основі розшифрованої первинної структури білка чи РНК які кодуються цим геном.

Синтезували ген, який кодує структуру аланіновоїт-РНК пекарських дріжджів:

1. Встановили послідовність нуклеотидів в гені на основі послідовності нуклеотидів в т-РНК;

2. Синтезували фрагменти довжиною 4-13 нуклеотидних пар;

3. З’єднали окремі фрагменти за допомогою Т4-полінуклеотидлігази (виділена з фага Т4);

4. Отримали ген довжиною 77 нуклеотидних пар, але він був неактивний, бо не мав регуляторних ділянок (промотора і термінатора).

У 1976 році у цій же лабораторії синтезували ген тирозиновоїт-РНК:

1. Довжина 126 пар нуклеотидів, сюди входили промотор (52 пари) і термінатор (21 пара).

2. До кінців гена були прикріплені “липкі” кінці ААТТ і ТТАА.

3. Цей ген вмонтували в геном бактеріофагу λ і потім ввели в бактеріальну клітину.

Недоліки отримання генів методом хімічного синтезу:

• Сам метод трудомісткий;

• Розшифровка генів еукаріот ускладнена їх екзон-інтронною будовою.

• Великі за розміром гени складно синтезувати.

У практиці генної інженерії широко поширений і третій метод штучного одержання генів, заснований на їх ферментативному синтезі з допомогою механізму зворотної транскрипції. Цей механізм пов'язаний з активністю РНК-залежноїДНК-полімерази або зворотної транскриптази - ферменту, вперше виявленого при дослідженні реплікації РНК онкогенних вірусів. Фермент здатний будувати ДНК-копії на різних РНК, включаючи синтетичні полірибонуклеотиди. За допомогою зворотної транскриптази, званої іноді ревертаза, можна синтезувати практично будь-який індивідуальний ген в присутності відповідних іРНК, методи виділення яких достатньо розроблені. У 70-і роки з'явилися методи виділення в чистому вигляді фрагментів ДНК за допомогою електрофорезу. У руки вчених потрапили "молекулярні ножиці".

Транспортним засобом перенесення генетичної інформації в клітину став вірус. Явище трансдукції - перенесення генів з однієї клітини в іншу за допомогою вірусів вивчали ще з 50-х років. Але вірус не повинен був відразу знищувати всю клітину, тому не всі віруси підходили для цієї ролі. Відомо, що бактеріальні клітини можуть обмінюватися генетичним матеріалом за допомогою плазмід (невеликих частинок з фрагментами ДНК). Тому введення потрібного гена в плазміду дозволяє в подальшому перенести цей ген в бактерію (це ще один з механізмів транспорту в генній інженерії). З'явилася можливість вивчати розподіл нуклеотидів в певному гені або отримувати потрібний білок. Для цього створюється рекомбінантна ДНК, яка виникає, коли ДНК одного організму впроваджується в клітини іншого. В якості останнього використовуються клітини організму, який розмножується багато швидше першого, наприклад, бактерії. Так, у 80-і роки були розроблені інтерферони - білки, здатні пригнічувати розмноження вірусів. Були обрані найбільш підходящі для перенесення гени і мобільні ділянки ДНК. Наприклад, культурним рослинам вводять гени, що підвищують їх імунітет і стійкість.

У 1983р. БарбараМак-Клінток при вивченні генетики кукурудзи виявила в її геномі один "моторний" ген, відповідальний за колір качана. Незалежно від ніс рухливі гени були відкриті методами молекулярної генетики радянським ученим Г. П. Георгісвим. У 1981 р. процес виділення генів і отримання з них різних ланцюгів був автоматизований.

Ферментативний синтез генів

У 1970 році в онкогенних вірусах відкрили фермент зворотну транскриптазу (ревертазу), за допомогою якого ДНК транскрибується з молекул і-РНК.

У 1972 році (США) отримали ділянку ДНК, що була геном глобіну кроля:

1. Виділяють молекули і-РНК необхідного гена.

2. На 3’-кінці така молекула і-РНК має кілька аденіловихнуклеотидів. До них приєднують ще кілька таких нуклеотидів.

3. Вносять “затравки” – олігонуклеотиди тиміну (комплементарні аденіловим), які ініціюють процес утворення пар А-Т.

4. В середовище вносять дезокситрифосфати (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ) та фермент зворотнютранскиптазу (виділена з віруса пташиного міобластозу) – проходить зворотне транскрибування.

5. Після завершення транскрипції ланцюга ДНК на матриці і-РНК, отриманий комплекс ДНК-і-РНК обробляють лугом або РНК-азою, щоб звільнити ланцюг ДНК.

6. На одному ланцюзі ДНК здійснюють комплементарний синтез другого ланцюга ДНК (процес аналогічний реплікації).

Недоліки ферментативного синтезу генів

• Отриманий таким чином ген не є повноцінний, бо не має регуляторних ділянок (промотора і термінатора) та інтронів, оскільки в і-РНК немає інформації про ці частини гена.

• Промотор і термінатор синтезують хімічним способом і приєднують до гена.

• Щоб в гені були інтрони треба виділити не і-РНК, а про-і-РНК, яка не пройшла сплайсингу і містить інтрони.

За останні 10-15 років були створені принципово нові методи маніпулювання з нуклеїновими кислотами invitro, на основі яких зародився і бурхливо розвивається новий розділ молекулярної біології та генетики - генна інженерія. Поняття «генна» і «генетична» інженерія часто вживають як синоніми, хоча останнє є більш широким і включає маніпулювання не тільки з окремими генами, а й з більш великими частинами геному. Робота по переробці генотипу тварин чи рослин за допомогою схрещувань обмежені межами виду або близьких у видовому відношенні форм. Навпаки, генна інженерія, як буде показано нижче, стирає міжвидові бар'єри, забезпечуючи можливість створення організмів з новими, в тому числі і не зустрічаються в природі, комбінаціями спадкових властивостей.

Генна інженерія є сукупність методів, що дозволяють не тільки отримувати реконбінантние ДНК із фрагментів геномів різних організмів, але і вводити такі рекомбінантні молекули в клітину, створюючи умови для експресії в ній введених, часто абсолютно чужорідних генів.

Таким чином, в цьому випадку дослідник оперує безпосередньо з генами, причому їх перенесення може не залежати від таксономічного спорідненості використовуваних організмів. Ця особливість генної інженерії представляє її головна відмінність від раніше використовувалися прийомів зміни генотипу.

Використана література:

1.Герасименко.В.Г. та інші.Біотехнологія. Підручник. Київ 2006.

2.www.reff.net.ua

3.www.referatu.net.ua

4. www.biosafety-center.dp.ua/viddil.../Biotehnologi_Gerasimenko.pdf

Дата добавления: 2015-09-28