АНАЛИЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ (1).
Задание 1. Определение концентрации двуцепочечной ДНК в растворе. Гиперхромный эффект.
Пуриновые и пиримидиновые основания поглощают в ультрафиолетовой области спектра с максимумом при 260 нм. При этой же длине волны наблюдается и максимальное поглощение ДНК. Эмпирически определено количественное соотношение между концентрацией двуцепочечной ДНК в растворе и величиной оптического поглощения при 260 нм:1единица оптического поглощения
соответствует концентрации 50 мкг/мл ДНК. Полезно знать отношение величин оптических поглощений при 260 и 280. Данное соотношение может служить показателем присутствия примесей белка в полученном препарате ДНК. Величина отношения 1,7 и более свидетельствует о высокой степени чистоты препарата ДНК.
Денатурация ДНК. Раствор высоко очищенной двуцепочечной ДНК обладает при рН 7 и 25ºС очень высокой вязкостью. При нагревании раствора до 70 - 80ºС или добавлении концентрированной кислоты или щелочи вязкость раствора ДНК резко снижается. Это связано с разрывом водородных связей между комплементарными основаниями и переходом ее в одноцепочечную форму. Процесс нарушения вторичной структуры ДНК, сопровождаемый разрывом двойной спирали, называется денатурацией, или плавлением, и происходит очень быстро при строго определенной температуре
Температурой плавления (Тпл) называется та температура, при которой разрушается половина водородных связей.
Данный показатель является важной характеристикой молекул ДНК. Тпл существенно зависит от длины молекулы ДНК и ее нуклеотидного состава, а также от ионной силы раствора. Зависимость Тпл от длины молекулы может быть выражена формулой:
1/Тпл = А + В/N,
где N – длина цепи ДНК, А и В – константы, уникальные для каждой экспериментальной системы. Данное выражение справедливо для коротких олигонуклеотидов до 20 пар нуклеотидов длиной. Более длинные цепи имеют мало отличающиеся Тпл.
Помимо уменьшения вязкости денатурация ДНК сопровождается резким изменением и других физических свойств. Так, увеличивается отрицательный угол вращения плоскости поляризации; увеличивается плавучая плотность (положение молекулы ДНК в градиенте плотности хлористого цезия при ультрацентрифугировании); резко возрастает поглощение света при 260 нм. Такое возрастание поглощения называется гиперхромным эффектом и может быть использовано в качестве экспериментального критерия денатурации ДНК и определения точки плавления (рис.6).
Рис.6. Наблюдение гиперхромного эффекта при длине волны 260 нм при денатурации ДНК
Ход работы:
1. Приготовить 2 параллельные пробы следующего состава: а) к 1 мл раствора ДНК (из эритроцитов кур) прибавить 2 мл буфера ТЕ (10 мМ трис-НС1, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0); Пробы тщательно перемешать.
2. Измерить оптическое поглощение проб на спектрофотометре при длинах волн 260 и 280 нм. Пробы слить обратно в пробирки (для следующего задания). В качестве спектрофотометрического контроля использовать буфер ТЕ.
3. По полученным данным рассчитать:
4. Измерить концентрацию ДНК в растворе с использованием флюориметра Qubit.
5. Сравнить полученные данные с результатом измерения на спектрофотометре.
6. 2 пробы по 3 мл раствора ДНК (после измерений концентраций) кипятить на водяной бане 15 мин. При этом происходит денатурация ДНК.
7. Пробы быстро (для предотвращения ренатурации) опустить в ледяную баню и охлаждать в течение 5 мин.
8. Измерить оптическое поглощение при 260 нм (А260) денатурированной ДНК в растворах. В качестве спектрофотометрического контроля использовать буфер ТЕ.
9. Вычислить изменение величины оптической плотности (ΔА260) при денатурации для препарата ДНК, используя результаты, полученные в п.3.
Задание 2. Выделение плазмидной ДНК с помощью набора GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas)
Существующие методы очистки плазмидной ДНК включают три основных этапа: рост бактерий и амплификацию плазмиды; сбор бактерий и их лизис; очистку плазмидной ДНК. Во всех методах очистки используется различие в размерах и конформации хромосомной и плазмидной ДНК (хромосомная ДНК намного больше и выделяется преимущественно в линейной форме, тогда как плазмидная ДНК выделяется в виде суперспирализованных или в меньшей степени релаксированных кольцевых молекул). В последнее десятилетие получили широкое распространение методы очистки плазмидной ДНК на центрифужных колонках, содержащих ионообменники на основе кремния.
Набор GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas) предназначен для быстрого выделения и очистки плазмидной ДНК из небольших объемов (1 - 5 мл культуры E.coli). Получаемая плазмидная ДНК характеризуется высокой степенью чистоты и пригодна для использования в большинстве молекулярно-биологических методов: клонирование, переваривание эндонуклеазами рестрикции, ПЦР-амплификация, автоматическое секвенирование. Набор позволяет проводить эффективную очистку плазмид любого размера и космид. Из 5 мл культуры с оптической плотностью А600 ~ 2,5 можно получить до 20 мкг плазмидной ДНК в зависимости от копийности плазмиды и среды культивирования бактериальных клеток.
В основе предлагаемого метода выделения плазмидной ДНК лежит метод щелочного лизиса, предложенный Бирнбоймом и Доли в 1979 г. На первом этапе разрушается углеводная оболочка бактерий, затем под действием сильно щелочного раствора с детергентом (в исходном варианте 0,2 н NaOH и 1% додецилсульфат натрия) полностью разрушается бактериальная клетка и плазмидная ДНК выходит в раствор. Третий этап – нейтрализация и центрифугирование с целью освобождения от фрагментов клеток и хромосомной ДНК. Затем супернатант переносится на центрифужную мини-колонку. Использование специальных растворов обеспечивает селективное связывание плазмидной ДНК с колонкой, а денатурированные белковые компоненты легко удаляются последующей промывкой. Очищенная плазмидная ДНК элюируется буфером с низкой ионной силой (10 мМ Tris-HCl, pH 8,5) и может быть использована для дальнейшей работы.
Рис.1 Схема плазмидного вектора pUC19 Рис. 2. Схема плазмиды рТО Е-3,7, содержащей вставку из гена tdo крысы
На практикуме для трансформации и выделения используется плазмида pUC 19 (рис.1) и рекомбинантная плазмида рТО(Е-3,7) (рис.2), созданная на основе этого вектора и содержащая вставку эукариотического гена триптофандиоксигеназы (tdo) размером 3700 п.н. Вектор pUC 19 размером 2686 п.н. имеет ориджин репликации из плазмиды pBR 322, ген устойчивости к ампициллину, полилинкер (multiple cloning site, MCS), содержащий уникальные сайты рестрикции, а также ген LacZ, позволяющий использовать сине-белый тест для отбора колоний с рекомбинантными плазмидами при трансформации штаммов E.coli, мутантных по α-пептиду гена β-галактозидазы.
Ход работы.
Все процедуры по выделению проводятся при комнатной температуре.
а) Перенесите 1,5 мл культуры бактерий E.coli, выращенной в течение ночи (ночная культура), в микропробирку для центрифугирования. Осадите клетки центрифугированием при 6800 g в течение 2 мин при комнатной температуре.
б) Супернатант аккуратно слейте и выбросьте. Все остатки среды удалите пипеткой.
а) Добавьте 250 мкл ресуспендирующего буфера (R) к бактериальному осадку и тщательно ресуспендируйте осадок с использованием Вортекса.
Неполное ресуспендирование приведет к уменьшению выхода плазмидной ДНК!
б) Добавьте 250 мкл лизирующего буфера (L) и сразу же перемешайте содержимое, плавно переворачивая пробирку вверх-вниз (4 - 6 раз). Раствор должен стать прозрачным и вязким.
На этом этапе нельзя использовать Вортекс (иначе могут появиться разрывы в хромосомной ДНК). Нельзя инкубировать пробу в этом растворе более 5 мин, так как может денатурировать плазмидная ДНК, что приведет к уменьшению выхода.
в) Добавьте 350 мкл нейтрализующего буфера (N) и сразу же перемешайте содержимое, тщательно, но плавно переворачивая пробирку вверх-вниз (4 - 6 раз).
Осадок должен стать дисперсным, что обеспечит эффективную очистку плазмидной ДНК. Не трясите пробирку слишком сильно, так как при этом обломки геномной ДНК E.coli могут загрязнить препарат плазмидной ДНК.
г) Цетрифугируйте пробы при 14000 g в течение 5 мин.
д) Пока идет центрифугирование, поместите мини-колонку в специальную пробирку для сбора элюата.
а) Осторожно перенесите осветленный супернатант в мини-колонку и закройте крышечку. Центрифугируйте мини-колонку с пробиркой при 14000 g в течение 1 мин. Удалите жидкость из пробирки для сбора элюата.
Следите, чтобы фрагменты осадка не попали в мини-колонку! На всех этапах работы с мини-колонкой не допускайте контакта наконечника пипетки с мембраной колонки.
а) Добавьте 500 мкл буфера для промывки (W) в колонку и центрифугируйте при 14000 g в течение 1 мин. Удалите жидкость, прошедшую через мини-колонку, затем поместите мини-колонку в прежнюю пробирку для сбора элюата.
б) Снова добавьте 500 мкл буфера для промывки (W) в колонку и центрифугируйте при 14000 g в течение 1 мин. Удалите жидкость, прошедшую через мини-колонку, затем поместите мини-колонку в прежнюю пробирку для сбора элюата.
в) Для удаления остатков промывочного буфера центрифугируйте мини-колонку с пробиркой при 14000 g в течение 1 мин.
а) Перенесите мини-колонку в чистую центрифужную пробирку и добавьте 50 мкл буфера для элюции (E) прямо в центр колонки, но не касаясь мембраны; инкубируйте колонку 2 мин при комнатной температуре. Центрифугируйте мини-колонку с пробиркой при 14000 g в течение 2 мин. Элюат в центрифужной пробирке будет содержать очищенную плазмидную ДНК.
б) Подписать пробирку и хранить при -20°С до следующего занятия.
Дата добавления: 2015-08-29; просмотров: 132 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая лекция | | | следующая лекция ==> |
| Федеральное агенство по образованию | | | Анализ нуклеиновых кислот (1). |