Фаговый дисплей: принцип метода и использование в технологии рекомбинантных антител.

Фаговый дисплей: принцип метода и использование в технологии рекомбинантных антител.

Аннотация

Технология фагового дисплея применяется уже более 20 лет и сегодня, когда получение антител для терапии или фундаментальных исследований требует скрининга сотен и тысяч кандидатов, этот метод получает все большее распространение. В данном обзоре рассматриваются базовые принципы технологии фагового дисплея, конструирование антительных библиотек и основные стратегии отбора, которые необходимы для успешной селекции фрагментов антител, специфичных к конкретному антигену.

Введение

Дисплей пептидов и белков на нитчатом фаге - фаговый дисплей – это технология in vitro отбора, которая дает возможность выделять полипептиды с желаемыми свойствами из огромного набора вариантов. Принцип, лежащий в основе технологиифагового дисплея – это непосредственная связь фенотипа белка и соответствующего ему генотипа.

Фаговый дисплей позволяет экспонировать обширные библиотеки (10⁹ - 10¹¹ вариантов) пептидов и белков на поверхности нитчатого фага, которые подвергаются селекции в сторону высоко аффинного и специфичного полипептида почти к любой мишени. Методика включает в себя внедрение нуклеотидной последовательности экзогенного белка непосредственно в геном капсидного белка бактериофага. Закодированный полипептид экспрессируется на поверхности фага, как продукт слияния с одним из белков оболочки [1].

Еще одной сильной стороной данного метода является высокая устойчивость фаговых частиц, без потери способности к заражению бактерий, к критическим условиям, таким как экстремальные значения pH и температуры [2], присутствие ДНКаз или протеолитических ферментов [3]. Это позволяет не ограничивать стратегии селекции при отборе наиболее аффинных вариантов, то есть при биопэннинге.

Сегодня намечен значительный прогресс в развитии технологии фагового дисплея, включая использование обширных антительных библиотек фага для обнаружения новых терапевтических мишеней, и методы для отбора биологически активных лигандов [4]. Таким образом, данный метод оказал сильное влияние на такие важные направления в биологии как иммунология, клеточная биология, биотехнология, фармакология и разработка лекарств.

Основная часть

Строение фаговой частицы

Нитчатые фаги относятся к большому семейству вирусов, заражающие грамм отрицательные бактерии. Их геном представлен кольцевой одноцепочечной ДНК (оцДНК), которая заключена в гибкую, цилиндрическую белковую оболочку. Бактериофаг М13 широко используется в работе с фаговым дисплеем. Размер фаговой частицы обычно составляет около 900 нм в длину и 6-7 нм в диаметре. Одноцепочечная ДНК (6407 п.о.) кодирует 11 генов: три гена, 2р, 10р, 5р, требуются для образования оцДНК, три, 1р, 11р, 4р, необходимы для сборки фага и пять остальных генов, 3р, 6р, 7р, 8р, 9р, являются компонентами фаговой частицы [5]. Основным белком оболочки фага является белок pVIII, представленный в количестве 2700 копий и ответственный за инкапсулирование фаговой ДНК. Дистальный конец фаговой частицы несет пять копий каждого из белков pVII и pXIX. На проксимальном конце представлены белки pVI и pIII, по 4-5 копий каждого.

Бактериофаг М13 инфицирует только женский тип бактерий, т.е. клетки E. coli, несущие F – плазмиду, которая кодирует F – пили. Заражение происходит в результате взаимодействия между рIII белком фага и F – пилем. Нитчатые фаги не имеют литического жизненного цикла, они реплецируются и выходят на протяжении всего периода роста и деления клетки.

Структура и функции белка рIII хорошо изучены. Он ответственен за способность фага заражать бактерии и за выход фага из клетки в процессе сборки [6]. Белок рIII состоит из трех доменов, соединенных двумя глицин – сериновыми линкерами: N1, N2 – это N – конец и СТ – домен на С – конце полипептида. На первом этапе основную роль выполняет домен N2, который узнает и связывается с бактериальным F - пилем. После этого домен N1 имеет возможность прикрепиться к трансмембранному белку клетки TolA, после чего и происходит проникновение ДНК фага в клетку. СТ – домен необходим для завершения сборки фаговой частицы в периплазме бактерии и выделения фага наружу [7].

При отборе белков с помощью фагового дисплея для их экспонирования на поверхности фаговой частицы используют все пять капсидных белков, но с различной частотой. При выборе корового белка, с которым будет объединена последовательность антитела и для экспонирования на фаге, наибольшее предпочтение отдают белкам рIII и рVIII (рис.1). Последовательность целевого белка для дисплея обычно помещается на N-конец последовательности корового белка, между сигнальной последовательностью и началом последовательности белка оболочки. Однако на каждой копии рVIII в вирионе может быть экспонирован только короткий пептид, так как большой размер белка препятствует упаковке фаговых частиц, что, возможно, объясняется ограниченным размером канала, через который фаг выходит наружу. Белок pIII, присутствующий в пяти копиях на проксимальном конце вириона, используется для слияния с целевым белком в большинстве случаев благодаря его устойчивости к вставкам большого размера, совместимости с моновалентным дисплеем и возможности использовать его в системе многих векторов [9]. Хотя рIII более толерантен, чем рVIII к существенным вставкам, способность к заражению клеток, вызываемая фагом, может быть снижена, иногда заметно. Для решения этой проблемы используют укороченный вариант белка рIII.

Рис. 1. Бактериофаг М13 с экспонированным фрагментом антитела на поверхности фаговой частицы, слитым с белком оболочки фага pIII [8].

Форматы фагового дисплея

Наибольшее распространение фаговый дисплей получил в работе с антителами. Можно выделить две области применения фагового дисплея, связанные с аффинной селекцией антител: 1) создание антител de novo, 2) повышение аффинности ранее полученных антител. Выбор источника генного репертуара – это первый шаг в конструировании комбинаторных фаговых библиотек антител. В зависимости от источника генного репертуара можно выделить несколько типов антительных библиотек: наивные, иммунные или синтетические.

Наивные и иммунные библиотеки конструируют, используя естественным образом реорганизованные гены, кодирующие домены иммуноглобулинов здоровых людей или иммунных к какому-либо антигену доноров, соответственно. Чаще всего это лимфоциты периферической крови, в некоторых случаях используют клетки миндалин и лимфоциты костного мозга [10].

Синтетические библиотеки получают в результате замены природных гипервариабельных участков антител (CDR) на набор случайных последовательностей, что позволяет создавать огромное разнообразие антигенсвязывающих сайтов.

Репертуар антител, полученных после иммунизации, в основном ограничен набором антител против антигенов, инициирующих естественный иммунный ответ. Конструирование такой природной библиотеки требует использование таких молекулярных методов, как обратная транскрипция на мРНК, полимеразная цепная реакция (ПЦР) с генспецифическими праймерами для наработки вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей антитела (VL и VH, соответственно) и клонирование перестроенных антительных сегментов в соответствующий фагмидный вектор. Ограничивающим фактором для получения обширной библиотеки во всех случаях является этап трансформации. Даже если он оптимизирован, библиотека размером 10⁸ – 10¹¹ может быть получена только после проведения большого количества трансформаций [11].

Следует заметить, что антитела, полученные с помощью гибридомной технологии или фагового дисплея, часто не могут использоваться для терапевтических целей или для чувствительной диагностики из-за недостаточно высокой аффинности. Показатель способности антитела связывать антиген может быть улучшен с помощью фагового дисплея, что относится ко второму направлению применения данного метода.

Сегодня при работе с фаговым дисплеем наиболее успешно применяются следующие форматы антител: одноцепочечный вариабельный фрагмент антитела (scFv) и антигенсвязывающий фрагмент антитела (Fab). Fab - фрагменты обычно более стабильны, чем Fv фрагменты и меньше склоны к димеризации, чем scFv [12]. Fab фрагменты с меньшей частотой экспонируются на поверхности фага, что исключает вероятность авидного эффекта, который может наблюдаться с некоторыми хорошо экспрессируемыми scFv. С другой стороны, scFv фрагменты менее токсичны для клеток, чем большие Fab фрагменты [12], что способствует более высокому уровню продукции и разнообразию библиотеки. Как правило, для дисплея целевого белка на поверхности фаговой частицы используется хелперный фаг M13 К07, таким образом, фрагменты антител экспрессируют в виде гибридных белков с белками оболочки фага pIII, pIV и pVIII. Из отобранных фаговых частиц затем выделяют фаговую кДНК и определяют нуклеотидную последовательность фрагментов антител. На основе этой последовательности в дальнейшем создают полноразмерные рекомбинантные антитела.

Схема фагового дисплея

Общая схема работы с фаговым дисплеем представлена на рисунке 2. Гены, кодирующие целевой белок, клонируют в фагмиды, которыми трансформируют клетки E. coli. Бактериальные клетки заражают фагом помощником, в результате чего получают библиотеку фрагментов антител, экспонированных на поверхности фаговых частиц. Библиотека из 10⁸–10¹⁰ вариантов фрагментов антител инкубируется с иммобилизованным антигеном. За несколько этапов промывания удаляют низкоаффинные фаговые частицы, затем элюируют оставшиеся связанными с антигеномфаговые частицы. Отобранные после первого цикла частицы амплифицируют путем инфицирования клеток E. coli для генерации библиотеки, обогащенной вариантами фрагментов антител, взаимодействующих с антигеном с высокой аффинностью. Данный цикл, biopanning, повторяется от двух до четырех раз до тех пор, пока фракция высокоаффинных антител не станет доминирующей. Результатом использования фагового дисплея является отбор высокоаффинных вариантов антител, гены которых могут быть выделены из фаговых частиц для последующего клонирования и экспрессии.

Рис. 2. Схема фагового дисплея. [13, 14].

При работес фаговым дисплеем используют векторы на основе природной последовательности фага – фаговый вектор – или фагмиду [15]. Фагмида - это вектор, который несет сайты инициации репликации, как для нитчатых фагов, так и для бактериальной плазмиды. Этот вектор, сконструированный на основ е плазмиды, содержит только гены антитела, слитые с генами белка оболочки, и никаких других фаговых генов. В первом варианте, с исходным вектором фага, полипептидная последовательность помещается прямо в кодирующую последовательность белка оболочки. Таким образом, после трансформации клеток, фаг будет продуцировать все копии этого корового белка с пришитой к ним полипептидной последовательностью, в результате чего мы имеем дело с поливалентным фагом. В фагмидном векторе ген целевого белка клонируют под контроль слабого промотора, получая в результате моновалентный фаг [16]. Моновалентный дисплей позволяет осуществлять селекцию клонов, основываясь только на их уровне аффинности. Такая стратегия используется в большинстве исследований, где целью является выявление из библиотеки вариантов с наибольшей силой связывания.

Использование фагмиды имеет еще ряд преимуществ перед использованием фагового вектора [17]: 1) геномы фагмид меньше и могут вмещать чужеродный фрагмент ДНК большего размера, 2) фагмиды эффективней при трансформации, что позволяет получать библиотеки с большим разнообразием, 3) множественные сайты рестрикции удобны для ДНК рекомбинации и генных манипуляций, 4) уровень экспрессии пришитого белка может легко контролироваться и модулироваться исследователем, 5) фагмида обычно генетически более стабильна в поколениях, чем рекомбинантный фаговый вектор.

Исходя из этого, можно заключить, что к основным компонентам фагмиды относятся:

1) сайт инициации репликации в бактериях,

2) селективный маркер,

3) межгенная область – IG область, которая обычно содержит сигнальную последовательность для упаковки фага и сайт инициации репликации – и + цепей фага,

4) гены, кодирующиебелок оболочки фага,

5) полилинкер, включающий в себя необходимые для клонирования сайты рестрикции,

6) промотор (например, lac, tet – контролируемый).

Дополнительно в кассету, кодирующую гибридный белок (например, pIII-scFV), может быть встроен сигнальный пептид, который необходим для направления синтезируемого белка в область клетки, где будет осуществлена правильная сборка (например, сигнальные пептиды к внешней мембране: pelB, stII, CAT); поли-His, myc tag – последовательности для детекции отдельных клонов иаффинной очистки белка; амбер – кодон TAG, который помещается между генами белка оболочки и генами экспонированного белка для экспрессии растворимой формы целевого белка. В supE штаммах XL-1 Blue MRF, TG1, DH5aF, 16C9, ER2738, ER2537 TAG – кодон узнается как глутаминовая кислота вместо стоп-кодона. Стоп-кодон необходим для получения целевого белка в растворимом виде без переклонирования конструкции в другой вектор.

Заражение бактериальных клеток, сборка и выход фаговых частиц осуществляется с участием хелперного фага, например, M13 K07, включающего в себя гены белков, отсутствующие в фагмиде [18]. При этом, так как фаг-помощник имеет собственные сайты инициации репликации минус и плюс цепи, белки репликации действуют не только на фагмиду, но и на сам хелперный фаг. Однако, благодаря мутациям в сайте инициации репликации ДНК хелперного фага, оцДНК фага нарабатывается в значительноменьшем количестве, чем оцДНК фагмиды [19]. Также фаги-помощники имеют селективный маркер – ген устойчивости к антибиотику, чтобы отбирать зараженные фагом клетки.

Для того чтобы обнаружить и выделить из библиотеки полипептиды с заданными биологическими свойствами, применяют различные методы скрининга. Селекция включает последовательное увеличение специфически связывающихся фагов и избавление от не связавшихся или слабо связывающихся на последующих этапахклонов. Это достигается с помощью нескольких раундов связывания фаговых частиц, несущих на себе различные варианты антител, с антигеном, отмывки неспецифических фагов и элюции аффиносвязавшихся фагов для их амплификации и дальнейшего использования. Все методы селекции можно разделить на две категории, в зависимости от презентации антигена: на твердой подложке или в растворе. В рамках селекции первого типа антиген адсорбируют на поверхности лунок плашке или пришивают на колонку [20]. Селекция в растворе зависит от прикрепления фага, с экспонированным на его поверхности антителом, к свободно двигающейся частице, например, магнитным шарикам, несущим на поверхности антиген, или живым клеткам [21]. Также белок или небелковый лиганд может быть биотинилирован [22].

Часто применяемый способ первичного описания свойств отобранных клонов, в частности для исследований, основанных на селективном связывании лигандов – это иммуноферментный анализ(ИФА). В этом методе интересующая мишень иммобилизуется на поверхности 96 – луночного планшета, к ней добавляют супернатант индивидуальных фаговых частиц, которые были отобраны с помощью фагового дисплея. В результате специфическое связывание белков, экспонированных на отдельных частицах фага, детектируется с помощью антифаговых антител. На заключительном этапе исследования осуществляют синтез выделенных пептидов в растворимом виде и их всестороннее изучение в очищенном виде.

Из отобранных фаговых частиц затем выделяют фаговую кДНК и определяют нуклеотидную последовательность фрагментов антител.

Заключение

На сегодняшний день уже существует несколько примеров антител, полученных с помощью фагового дисплея, которые используются в терапевтических целях. Интересно отметить, что из 131 антитела для клинического применения в период с 2001 по 2008 год, почти 27% было получено при использовании фагового дисплея [23]. Так, ярким примером успешного применения этого метода является препарат Адалимумаб (Хумира), являющийся первым терапевтическим антителом, который был получен с помощью фагового дисплея. Адалимумаб – моноклональное антитело против фактора некроза опухоли альфа (ФНО-α), полностью идентичное человеческим антителам. Адалимумаб был одобрен в 2003 году Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (США, FDA) для лечения ревматоидного артрита, а в 2012 году стал наиболее продаваемым препаратом в мире [8], благодаря высокой аффинности (К_д = 100 пМ) [24] и низкой иммуногенности.

Таким образом, технология фагового дисплея, являясь достаточно простой, быстрой и экономичной, позволяет выделять новые антитела, обладающие уже высокой аффинностью, или увеличивать значение аффинности, полученных ранее антител, до К_{д =} 10^-10 М.

[1] Marco Antonio Arap (2005). Phage display technology - Applications and innovations. Genetics and Molecular Biology, 28, 1, 1-9.

[2] Brigati, J. R. & Petrenko, V. A. (2005). Thermostability of landscape phage probes. Anal. Bioanal. Chem. 382, 1346–1350.

[3] Larocca, D., Burg, M. A., Jensen-Pergakes, K., Ravey, E. P., Gonzalez, A. M. & Baird, A. (2002). Evolving phage vectors for cell targeted gene delivery. Curr. Pharm. Biotechnol. 3, 45–57.

[4] Beatrix Kotlan and Mark C. Glassy (2009). Antibody Phage Display: Overview of a Powerful Technology that Has Quickly Translated to the Clinic. Chapter 1 of Methods in Molecular Biology, vol. 562.

[5] Webster, R. E. (1996), ‘Biology of the filamentous bacteriophage’, in ‘Phage Display of Peptides and Proteins’, Academic Press Inc., San Diego, CA., pp. 1–20.

[6] Holliger, P. and Riechmann, L. (1997). A conserved infection pathway for filamentous bacteriophages is suggested by the structure of the membrane penetration domain of the minor coat protein g3p from phage fd. Curr. Biol., Vol. 5, pp. 265–275.

[7] Riechmann, L. and Holliger, P. (1997). The C-terminal domain of Tol A is the coreceptor for filamentous phage infection of E.coli. Cell, Vol. 90. pp. 351–360.

[8] Michael R. Kierny, Thomas D. Cunningham and Brian K. Kay (2012). Detection of biomarkers using recombinant antibodies coupled to nanostructured platforms. Department of Biological Sciences, University of Illinois at Chicago (UIC), Chicago, IL, USA.

[9] Barbas, C. F., Kang, A. S., Lerner, R. A. & Benkovic, S. J. (1991). Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces: the gene-III site. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 88, 7978–7982.

[10] Vaughan T.J., Williams A.J., Pritchard K., Osbourn J.K., Pope A.R., Earnshaw J.C., McCafferty J., Hodits R.A., Wilton J. and Johnson K.S. Human antibodies with sub-nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library. // Nat. Biotechnol. - 1996. - V.14. - P.309-314.

[11] Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C. and Wells, J. A. (2000). Phage display for selection of novel binding peptides. Meth. Enzymol., Vol. 328, pp. 333–363.

[12] Arndt, K. M., Muller, K. M. and Pluckthun, A. (2001). Helix-stabilized Fv (hsFv) antibody fragments: substituting the constant domains of a Fab fragment for a heterodimeric coiled coil domain. J. Mol. Biol., Vol. 312, pp. 221–228.

[13] http://utminers.utep.edu/rwebb/html/phage_display_libraries.html

[14] Carmela Dantas-Barbosa, Marcelo de Macedo Brigido and Andrea Queiroz Maranhao. (2012). Antibody Phage Display Libraries: Contributions to Oncology. Int. J. Mol. Sci. 13 (5), 5420-5440.

[15] McCafferty J, Griffiths AD, Winter G, Chiswell DJ (1990). Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature. Dec; 348(6301): 552-4.

[16] Lowman H.B. (1997). Bacteriophage display and discovery of peptide leads for drug development. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure, 26, 401.

[17] Breitling, F., Dubel, S., Seehaus, T., Klewinghaus, I. & Little, M. (1991). A surface expression vector for antibody screening. Gene, 104, 147–153.

[18] Du, D. & Zhang, R. (2009). Application and progress of helper phage in phage display. Microbiol. China, 36, 261–266.

[19] Huan Qi, Haiqin Lu, Hua-Ji Qiu, Valery Petrenko and Aihua Liu (2012). Phagemid Vectors for Phage Display: Properties, Characteristics and Construction. J. Mol. Biol. (2012) 417, 129–143.

[20] Winter G, Griffiths AD, Hawkins RE, Hoogenboom HR (1994). Making antibodies by phage display technology. Annu Rev Immunol.12:433–55.

[21] Wang JP, Liu YL, Teesalu T, Sugahara KN, Kotamrajua VR, Adams JD, et al (2011). Selection of phage-displayed peptides on live adherent cells in microfluidic channels. Proc Natl Acad Sci USA;108:6909–14.

[22] Steiner D, Forrer P, Pluckthun A (2008). Efficient selection of DARPins with sub-nanomolar affinities using SRP phage display. J Mol Biol. 382:1211–27.

[23] Nelson AL, Dhimolea E, Reichert JM (2010). Development trends for human monoclonal antibody therapeutics. Nat Rev Drug Discov 9: 76774.

[24] den Broeder A, van de Putte L, Rau R, Schattenkirchner M, Van Riel P, Sander O, et al (2002). A single dose, placebo controlled study of the fully human anti-tumor necrosis factor-alpha antibody adalimumab (D2E7) in patients with rheumatoid arthritis. J Rheumatol 29: 2288_98.

Дата добавления: 2015-08-29