Аминокисло́ты— органические соединения, в молекуле которых одновременно содержатся карбоксильные и аминные группы.

Блок 1 белки

Аминокисло́ты — органические соединения, в молекуле которых одновременно содержатся карбоксильные и аминные группы.

Протеиногенными называются 20 аминокислот, которые кодируются генетическим кодом и включаются в белки в процессе трансляции.

классификация-см рис.

чем выше полярность, тем более полярна молекула аминокислоты.

Неполярные: аланин, валин, изолейцин, лейцин, пролин, метионин, фенилаланин, триптофан,

Полярные незаряженные при pH=7:, серин, треонин, цистеин, аспарагин, глутамин, тирозин

Полярные заряженные отрицательно при pH=7: аспартат, глутамат

Полярные заряженные положительно при pH=7: лизин, аргинин, гистидин

Изоэлектрическая точка (pI) — кислотность среды (pH), при которой определённая молекула или поверхность не несёт электрического заряда. Общий заряд белка определяется боковыми группами аминокислот, которые могут быть положительно- или отрицательно-заряженными, нейтральными или полярными. Общий заряд белка при pH ниже изоэлектрической точки является положительным. Наоборот, при pH выше изоэлектрической точки общий заряд белка — отрицательный

Пептидная связь — вид амидной связи, возникающей при образовании белков и пептидов в результате взаимодействия α-аминогруппы (—NH2) одной аминокислоты с α-карбоксильной группой (—СООН) другой аминокислоты.

Связь между углеродным атомом и аминогруппой или карбоксильной группой способна к свободным вращениям, что позволяет полипептидной цепи принимать различные конфигурации.

Пептидные связи обычно расположены в транс-конфигурации, т.е. углеродные атомы располагаются по разные стороны от пептидной связи. В результате боковые радикалы аминокислот находятся на наиболее удалённом расстоянии друг от друга в пространстве

Пептидные связи очень прочны и самопроизвольно не разрываются при нормальных условиях, существующих в клетках нейтральная среда, температура тела.

В живых организмах пептидные связи в белках разрываются с помощью специальных протеолитических ферментов, называемых также протеазами.

Первичная структура белка -это последовательность расположения аминокислотных остатков в полипептиде. Особенности: 1) она генетически детерминирована и уникальна;2)стабильна,что обеспечивается дипептидными и в меньшей степени дисульфидными связями;3)много воариантов комбинаций аминокислот в цепи, повторения очень редки;4)определяет 2-.,3-ю и 4-ю структуру молекулы белка.

Методы выделения. 1.Высаливание-в дистиллированной воде белки плохо растворимы, но при увеличении ионной силы, гидратная оболочка уменьшается, это приводит к агрегации и выпадению белка в осадок; 2.Диализ;3.Гель-фильтрация-позволяет разделять белки по величине и форме молекул; 4. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия

Видовая специфичность первичной структуры. При изучении аминокислотных последовательностей гомологичных белков, выделенных из разных видов, было сделано несколько важных выводов. К гомологичным белкам относятся те белки, которые у разных видов выполняют одинаковые функции. Примером может служить гемоглобин: у всех позвоночных он осуществляет одну и ту же функцию, связанную с транспортом кислорода. В аминокислотных последовательностях гомологичных белков во многих положениях всегда находятся одни и те же аминокислоты - их называют инвариантными остатками. Вместе с тем в других положениях белков наблюдаются значительные различия: в этих положениях аминокислоты варьируются от вида к виду; такие аминокислотные остатки называются вариабельными.Наличие такой гомологии предполагает, что животные, из которых были выделены гомологичные белки, имеют общее эволюционное происхождение. Сведения о числе различий в аминокислотных последовательностях гомологичных белков из разных видов используют для построения эволюционных карт, отражающих последовательные этапы возникновения и развития различных видов животных и растений в процессе эволюции.

Вторичная структура- конфигурация полипептидной цепи,более компактная ее упаковка в спиральную или какую-либо другую конформацию.

Существует две основных конфигурации полипептидной цепи: альфа-спираль и бета-складчатый слой. a-Спираль представляет из себя правую спираль с одинаковым шагом, равным 3,6 аминокислотных остатков. a-Спираль стабилизируется внутримолекулярными водородными связями, возникающими между атомами водорода одной пептидной связи и атомами кислорода четвертой по счету пептидной связи. Т.о. свойства данного белка определяются свойствами боковых групп аминокислотных остатков: входящих в состав того или иного белка. Если боковые заместители гидрофобны, то и белок, имеющий структуру a-спираль гидрофобен. Примером такого белка является белок кератин, из которого состоят волосы. В результате получается, что a- спираль пронизана водородными связями и является очень устойчивой структурой. В складчатом слое пептидные цепи располагаются параллельно друг другу, образуя фигуру, подобную листу, сложенному гармошкой. Чем больше пептидных цепей входит в состав складчатого слоя, тем прочнее молекула белка.

Третичная структура -трехмерная пространственная структура, образуется за счет взаимодействия между радикалами аминокислот.

Связи, участвующие в формировании белков.Дисульфидные- образуются за счет взаимодействия SH-групп двух остатков цистеина.Предполагают,что эти связи стабилизируют структуру белка вне клетки и предотвращают их денатурацию (инсулин, иммуноглобулины). Водородные связи- возникают между гидрофильными незаряженными группами(такими как SH,OH) и любыми другими гидрофильными группами. Ионные связи -могут возникать между отрицательно заряженными карбоксильными группами радикалов аспарагиновой и глутаминовой кислот и положительно заряженными группами радикалов лизина, аргинина или гистидина. Гидрофобные связи -при укладке полипептидная цепь белка стремится принять энергетически выгодную форму, характеризующуюся минимумом свободной энергии. Поэтому гидрофобные радикалы стремятся объединиться внутри глобулярной структуры растворимых в воде белков. Между ними и возникает гидрофобное взаимодействие.В результате формируется гидрофобное ядро.

Четвертичная структура- пространственная ориентация нескольких полипептидных цепей с образованием макромолекулярного образования. Отельные полипептидные цепи-протомеры –не обладают биологической активностью приобретают ее при определённом способе пространственного объединения.Образовавшаяся молекула является олигомером. Четвертичная структура стабилизируется за счет не ковалентных связей между контактными площадками протомеров,комплементарных друг другу.

Доменная структура белка. Если в белке больше 200 ак,то пространственная структура формируется в виде нескольких доменов. Домен-участок полипептидной цепи, который в процессе формирования пространственной структуры приобрел независимо от других участков той же цепи конформацию глобулярного белка. Цепь иммуноглобулина ж состоит из 2 доменов.

Конформационная лабильность белков. Это склонность к небольшим изменениям конфирмации за счет разрыва одних и образования других слабых связей. Конформация белка может меняться при изменении химических и физических свойств среды, а также при взаимодействии белка с другими молекулами.При этом происходит изменения пространственной структуры не только участка контактирующего с молекулой, но и конфирмации белка в целом.

Денатурация. Разрыв большого количества слабых связей в молекуле белка приводит к разрушению её нативной конформации. Потеря нативной конформации сопровождается утратой специфической функции белков. Этот процесс носит название денатурации белков. При денатурации белков не происходит разрыва пептидных связей, т.е. первичная структура белка не нарушается.В денатурированном белке гидрофобные радикалы, которые в нативной структуре молекулы спрятаны внутри гидрофобного ядра, оказываются на поверхности. При достаточно высокой концентрации белка и отсутствии сильного отталкивающего заряда молекулы могут объединяться друг с другом гидрофобными взаимодействиями, при этом растворимость белка снижается и происходит образование осадка. Компактная, плотная пространственная структура нативного белка при денатурации резко увеличивается в размерах и становится легко доступной для расщепления пептидных связей протеолитическими ферментами. Термическая обработка мясной пищи перед употреблением не только улучшает её вкусовые качества, но и облегчает её ферментативное переваривание в пищеварительной системе. Кроме того, денатурирующим действием на пищевые белки обладает и кислая среда желудка, вызывающая денатурацию тех белков, которые не подвергались предварительной температурной обработке, а также оказывает денатурирующее действие на белки микроорганизмов, попавших в желудок с пищей.

Факторы, вызывающие денатурацию белков: 1)высокая температура (более 50 °С);2)интенсивное встряхивание раствора; 3) органические вещества (например, этиловый спирт, фенол и его производные) способны взаимодействовать с функциональными группами белков, что приводит к их конформационным изменениям;4)кислоты и щелочи, изменяя рН среды, вызывают перераспределение связей в молекуле белка;6)соли тяжёлых металлов (такие как медь, ртуть, серебро, свинец и др.) образуют прочные связи с важными функциональными группами белков (чаще всего с -SH), изменяя их конформацию и активность;

Применение денатурирующих агентов в биологических исследованиях и медицине. В биохимических исследованиях перед определением в биологическом материале низкомолекулярных соединений из раствора обычно удаляют белки. Для этой цели чаще всего используют трихлоруксусную кислоту. После её добавления в раствор денатурированные белки выпадают в осадок и легко удаляются фильтрованием. В медицине денатурирующие агенты часто используют для стерилизации медицинских инструментов и материала, а также в качестве антисептиков. Например, в автоклавах при высокой температуре стерилизуют медицинские инструменты и материалы. Фенол и его производные (крезол, резорцин) относят к известным антисептикам ароматического ряда. Обладающие высокой гидрофобностью, они эффективно действуют на вегетативные формы бактерий и грибы, вызывая денатурацию их белков. Эффективность антисептических свойств уменьшается с увеличением растворимости препарата в воде. Берёзовый дёготь - одна из основных составных частей мази Вишневского, содержит в своем составе фенол. Препарат, используемый для лечения ран, обладает высоким антимикробным действием. Значительное количество антисептиков представлено солями тяжёлых металлов. Их антимикробное действие связано с тем, что уже в довольно низких концентрациях они взаимодействуют с белками микроорганизмов, блокируют их SH-группы и изменяют их конформацию. Так, высокой антимикробной активностью обладает сулема - дихлорид ртути (HgCl2). Её используют для обработки рук и дезинфекции помещений. Антимикробными свойствами обладают и препараты серебра, такие как ляпис (AgNO3), колларгол (серебро коллоидальное), применяемые для обработки слизистых оболочек при инфекционных заболеваниях

Роль шаперонов в защите белков клеток от денатурирующих стрессовых воздействий. Шапероны, участвующие в защите клеточных белков от денатурирующих воздействий, как уже говорилось выше, относят к белкам теплового шока.При действии различных стрессовых факторов (высокая температура, гипоксия, инфекция, УФО, изменение рН среды и т.д.) в клетках усиливается синтез БТШ. Имея высокое сродство к гидрофобным участкам частично денатурированных белков, они могут препятствовать их полной денатурации и восстанавливать нативную конформацию белков. Установлено, что кратковременные стрессовые воздействия увеличивают выработку БТШ и повышают устойчивость организма к длительным стрессовым воздействиям. Так, кратковременная ишемия сердечной мышцы в период бега при умеренных тренировках значительно повышает устойчивость миокарда к длительной ишемии, вызванной стенокардией или закупоркой сосудов сердца тромбом. В настоящее время перспективными исследованиями в медицине считают поиски фармакологических и молекулярно-биологических способов активации синтеза БТШ в клетках.

Ренативация белков. Долгое время считалось, что процесс денатурации белков необратим. Однако оказалось, что некоторые очищенные и денатурированные белки способны в опытных условиях восстанавливать конформацию при удалении денатурирующих агентов.

Ренативация рибонуклеазы.В начале 60-х г. XX века обнаружили, что процесс денатурации белков может быть обратимым. Это открытие было сделано при изучении денатурации рибонуклеазы - фермента, расщепляющего связи между нуклеотидами в РНК. Рибонуклеаза - глобулярный белок, содержащий одну полипептидную цепь, состоящую из 124 аминокислотных остатков. Его конформацию стабилизируют 4 дисульфидные и множество слабых связей. Обработка рибонуклеазы меркаптоэтанолом приводит к разрыву дисульфидных связей и восстановлению SH-групп цистеиновых остатков, что нарушает компактную структуру белка. Добавление раствора мочевины или раствора гуанидинхлорида, вызывающих разрыв слабых связей в белке и образование новых водородных связей с денатурирующими агентами, приводит к образованию случайным образом свёрнутых полипептидных цепей рибонуклеазы, лишённых ферментативной активности, т.е. к денатурации фермента. Денатурирующие агенты не разрушают первичную структуру белка. Однако если путём диализа очистить рибонуклеазу от денатурирующих агентов и меркаптоэтанола, ферментативная активность белка постепенно восстанавливается. Этот процесс называется ренатурацией, или ренативацией белка. Сульфгидрильные группы денатурированного фермента под действием кислорода воздуха окисляются, в результате вновь возникают 4 дисульфидные связи, характерные для нативной структуры белка. Из 105 возможных способов связывания восьми SH-групп остатков цистеина реализуется только один вариант, характерный для нативной конформации белка.На основании этих опытов был выведен фундаментальный принцип молекулярной биологии: аминокислотная последовательность белков определяет их конформацию и специфическую функцию.

Физико-химические свойства белков. 1. Различия белков по форме:глобулярные и фибриллярные. 2. Различия белков по молекулярной массе: от 6000 до 1 000 000 Д и выше. 3. Растворимость белков. Растворимость белков в воде зависит от: формы, молекулярной массы, величины заряда, соотношения полярных и неполярных функциональных групп на поверхности белка. Кроме этого, растворимость белка определяется составом растворителя, т.е. наличием в растворе других растворённых веществ. Например, некоторые белки легче растворяются в слабом солевом растворе, чем в дистиллированной воде. Денатурирующие агенты, присутствующие в растворе, также снижают растворимость белков.

Факторы стабилизации белка в растворе. ГИДРАТНАЯ ОБОЛОЧКА - это слой молекул воды, определенным образом ориентированных на поверхности белковой молекулы. Поверхность большинства белковых молекул заряжена отрицательно, и диполи молекул воды притягиваются к ней своими положительно заряженными полюсами. Чем больше в составе белковой молекулы и на ее поверхности аминокислот с полярными (гидрофильными) радикалами, тем сильнее выражена и прочнее удерживается гидратная оболочка и тем больше в ней слоев. ЗАРЯД БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ. Поверхность большинства белковых молекул заряжена потому, что в каждой молекуле белка есть заряженные СОО- и NН3+ группы боковых радикалов аминокислот. ИЭТ - значение рН, при котором белок становится электонейтральным.

Изоэлектрическая точка. Значение рН раствора, при котором суммарный заряд белковых молекул равен нулю. Она определяется аминокислотным составом белка.

Методы выделения индивидуальных белков. 1.Высаливание. в дистиллированной воде белки плохо растворимы, но при увеличении ионной силы, гидратная оболочка уменьшается, это приводит к агрегации и выпадению белка в осадок;2) Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит. Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества. В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с "порами", через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной "пор".Неподвижная фаза - жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают, пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы.Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул.Так как гелевая структура сефадекса легко деформируется под давлением, гели стали заменять более жёсткими матрицами (сефактил, той-оперл), представляющими сферические гранулы с разными размерами пор. Выбор размеров пор в гранулах зависит от целей хроматографии (о других хроматографических методах будет сказано ниже);3)Ионообменная хроматография. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий.В качестве неподвижной фазы используют ионообменники.Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Так, для выделения отрицательно заряженного белка используют анионообменник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть буферными растворами с различной концентрацией соли, чаще всего NaCI, и разными значениями рН. Ионы хлора связываются с положительно заряженными функциональными группами анионообменника и вытесняют карбоксильные группы белков. При низких концентрациях соли элюируются белки, слабо связанные с анионообменником. Постепенное увеличение концентрации соли или изменение рН, что меняет заряд белковой молекулы, приводит к выделению белковых фракций, в одной из которых находится искомый белок;4)Аффинная хроматография, или хроматография по сродству. Это наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К лиганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом. Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом. Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз.

Многообразие белков. Глобулярные белки. Большинство индивидуальных белков человека относят к глобулярным белкам. Они имеют компактную структуру и многие из них хорошо растворимы в воде. Наглядные примеры строения и функционирования глобулярных белков - миоглобин и гемоглобины. Фибриллярные белки. К фибриллярным белкам относят коллагены, эластин, кератин, выполняющие в организме человека структурную функцию, а также миозин, участвующий в мышечном сокращении, и фибрин - белок свёртывающей системы крови.

Простые белки- построены только из остатков аминокислот(гистоны,альбумины,глобулины).

Сложные белки -состоят из белка и небелкового компонента (простетической группы).(фосфо-,хромо-,глико-,нуклео-,липо-,и металлопротеины).

Классификация белков по функциям: 1)ферменты;2)защитные белки(белки иммунной и свертывающей систем);3)сократительные белки;5)структурные белки(эластин);6)транспортные белки;7)рецепторные белки.

Сериновые протеазы. Это семейство ферментов, которые используют уникально активированный остаток серина, расположенный в активном центре, для связывания и каталитического гидролиза пептидных связей в белковых субстратах. Мишени для сериновых протеаз - специфические пептидные связи в белках (часто в других сериновых протеазах). Некоторые аминокислотные замены привели к изменению субстратной специфичности этих белков и к возникновению функционального многообразия внутри этого семейства. Так, пищеварительные сериновые протеазы участвуют в переваривании (гидролитическом расщеплении пептидных связей) денатурированных пищевых белков. К ним относят трипсин, химотрипсин, эластазу, но каждый из этих ферментов предпочитает разрывать пептидные связи, образованные определёнными аминокислотами. Суперсемейство иммуноглобулинов. Это суперсемейство включает по крайней мере три больших семейства белков: семейство иммуноглобулинов, семейство Т-клеточных антигенраспознающих рецепторов и белки главного комплекса гистосовместимости I и II классов. Основной критерий включения белков в суперсемейство иммуноглобулинов - их доменная организация. Кроме того, белки этого суперсемейства имеют схожие функции: иммуноглобулины взаимодействуют с чужеродными структурами, находящимися в крови, лимфе, межклеточной жидкости или секретах желёз, а рецепторы Т-лимфоцитов и белки главного комплекса гистосовместимости - с антигенами, находящимися на поверхности клеток данного организма.

Биуретовый метод — один из колориметрических методов количественного определения белков в растворе. Белки реагируют в щелочной среде с сульфатом меди с образованием комплексных соединений, окрашенных в фиолетовый цвет. По интенсивности окрашивания, которое пропорционально количеству белка, определяют содержание его в сыворотке крови.К достоинствам метода стоит отнести его низкую чувствительность к посторонним веществам, невысокую погрешность.

Электрофорез белков. Метод основан на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки - к катоду (-).Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам.Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле выше, чем на бумаге. Так,при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге обнаруживают только 5 главных фракций: альбумины, α1 глобулины, α2-глобулины, β-глобулины и γ-глобулины. Электрофорез тех же белков в полиакриламидном геле позволяет получить до 18 различных фракций. Для обнаружения белковых фракций полоски бумаги или столбики геля обрабатывают красителем (чаще всего бромфеноловым синим или амидовым чёрным). Окрашенный комплекс белков с красителем выявляет расположение различных фракций на носителе.

Дата добавления: 2015-08-27