Типы и механизмы питания и дыхания бактерий. Ферменты бактерий и их классификация. Значение изучения ферментативной активности для идентификации бактерий.

Питание

По источнику углерода бактерии делят на:

- автотрофы – источником является СО₂;

- гетеротрофы – источниками являются различные органические соединения (глюкоза, спирты, аминокислоты, органические кислоты);

По источнику энергии:

- фототрофы – используют энергию солнечного света;

- хемотрофы – используют энергию химических реакций окисления неорганических и органических соединений.

По донору Н₂ (е):

- литотрофы – донором являются неорганические соединения (Н₂О, H₂S);

- органотрофы – донором являются органические соединения (карбоновые кислоты, аминокислоты, глюкоза и т.д.).

По источнику азота:

- аминоавтотрофы – источником является атмосферный азот, аммонийные соли, нитраты, нитриты;

- аминогетеротрофы – источником являются белки (органические вещества).

Фотоавтотрофы – это фотосинтезирующие бактерии, использующие энергию солнечного света для синтеза органических соединений из неорганических соединений.

Хемоавтоторофы синтезируют органические вещества из СО₂ за счет энергии реакций окисления неорганических соединений. К ним относятся нитрифицирующие бактерии (NH₃ ® HNO₃), серобактерии (H₂S ® S; H₂SO₄), железобактерии (Fe²⁺ ® Fe³⁺).

Хемо(органо)гетеротрофы для синтеза собственных органических соединений используют энергию окисления других органических веществ, которые являются одновременно и источниками углерода. К ним относится большинство бактерий:

а) сапрофиты, использующие органические вещества отмерших организмов (бактерии брожения и бактерии гниения);

б) симбионты, использующие органические вещества других живых организмов, не нанося им вреда (образуют симбиоз);

в) паразиты, использующие органические вещества живых организмов, нанося им вред. Паразиты бывают облигатные (способны жить и расти только внутри живой клетки) и факультативные (после гибели хозяина питаются сапрофитно).

Микроорганизмы, способные синтезировать все соединения из глюкозы и солей аммония называются прототрофами.

Микроорганизмы, которые не способны синтезировать все соединения, называются ауксотрофами (многие патогенные бактерии).

Вещества, которые микроорганизмы не способны синтезировать, называются факторами роста. Они должны поступать в клетку в готовом виде. Это аминокислоты, витамины В₅, В₂, В₁, В₃, В₆, фолиевая кислота, парааминобензойная кислота (ПАБК).

У бактерий различают эндоферменты и экзоферменты. Эндоферменты находятся внутри бактериальной клетки, катализиру­ют внутриклеточные процессы обмена веществ. Экзоферменты выделяются во вне­шнюю среду и выполняют функцию расщепления сложных питательных веществ.
Методы определения ферментативной активности микробов Обязательным условием идентификации выделенной чистой культуры бактерий является определение ферментативной активности в отношении углеводов и белков (биохимический «паспорт» вида). Для выявления ферментов, расщепляющих углеводы (сахаролитические ферменты) используют дифференциально-диагностические среды Гисса. В состав сред Гисса входит пептонная вода, индикатор рН, поплавок для улавливания газа и один из углеводов (глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит, сахароза, крахмал и т.д.). Если бактерии расщепляют углевод, то образуется кислота и при этом меняется цвет среды за счет находящегося в ней индикатора рН. Большинство патогенных бактерий расщепляют углеводы с образованием только кислоты; некоторые виды ферментируют углеводы с образование кислоты и газа (СО2). При этом меняется цвет среды и в поплавке появляется пузырек газа. Протеолитическая активность бактерий. Показателями глубокого расщепления белка является образование индола, аммиака, сероводорода. Для выявления этих газообразных веществ делают посевы чистой культуры бактерий на мясо-пептонный бульон или пептонную воду в пробирки со специальными бумажными индикаторами. При наличии продуктов расщепления меняется цвет соответствующего индикатора. Протеолитическую активность бактерий определяют также путем посева чистой культуры уколом в столбик желатина по наличию и характеру разжижения среды, например, в виде перевернутой елочки, гвоздя, воронки и т.д.

Основные принципы культивирования бактерий. Требования, предъявляемые к питательным средам. Классификация питательных средств по назначению, их примеры. Состав и назначение МПА, МПБ, кровяного агара, сред Эндо, Левина и Плоскирева.

Для культивирования бактерий используют питательные среды, к которым предъявляется ряд требований:

1. Питательность.

2. Изотоничность. (поддержание осмотического давления)

3. Оптимальный рН (кислотность) среды. Кислотность среды обеспечивает функционирование ферментов бактерий; для большинства бактерий составляет 7,2–7,6.

4. Оптимальный электронный потенциал, свидетельствующий о содержании в среде растворенного кислорода. Он должен быть высоким для аэробов и низким для анаэробов.

5. Прозрачность (чтобы был виден рост бактерий, особенно для жидких сред).

6. Стерильность.

Классификация питательных сред.

1. По происхождению:

1) естественные (молоко, желатин, картофель и др.);

2) искусственные – среды, приготовленные из специально подготовленных природных компонентов (пептона, аминопептида, дрожжевого экстракта и т. п.);

3) синтетические – среды известного состава, приготовленные из химически чистых неорганических и органических соединений.

2. По составу:

1) простые – мясопептонный агар, мясопептонный бульон;

2) сложные – это простые с добавлением дополнительного питательного компонента (кровяного, шоколадного агара): сахарный бульон, желчный бульон, сывороточный агар, желточно-солевой агар, среда Китта—Тароцци.

3. По консистенции:

1) твердые (содержат 3–5 % агар-агара);

2) полужидкие (0,15—0,7 % агар-агара);

3) жидкие (не содержат агар-агара).

4. По назначению:

1) общего назначения – для культивирования большинства бактерий (мясопептонный агар, мясопептонный бульон, кровяной агар);

2) специального назначения:

а) элективные – среды, на которых растут бактерии только одного вида (рода), а род других подавляется (щелочной бульон, 1 %-ная пептонная вода, желточно-солевой агар, казеиново-угольный агар и др.);

б) дифференциально-диагностические – среды, на которых рост одних видов бактерий отличается от роста других видов по тем или иным свойствам, чаще биохимическим (среда Эндо, Левина, Гиса, Плоскирева и др.);

в) среды обогащения – среды, в которых происходит размножение и накопление бактерий-возбудителей какого-либо рода или вида (селенитовый бульон).

Методы выделения чистых культур аэробных бактерий. Основные этапы выделения чистой культуры. Работа 1-ого, 2-ого и 3-ого дня по выделению чистой культуры. Бактериологический метод исследования.

Этапы выделения чистых культур аэробных микроорганизмов:

1 - макро- и микроскопическое изучение исследуемого материала и посев на плотные питательные среды для получения отдельных колоний;

2 - макро- и микроскопическое изучение колоний и пересевов на скошенный агар;

3 - проверка культуры на чистоту и ее идентификация;

4 - вывод о выделенной культуре.

В первый день (1 этап исследования) в стерильную посуду (пробирка, колба, флакон) забирают патологический материал. Его изучают за внешним видом, консистенцией, цветом, запахом и другим признаками, готовят мазок, красят и исследуют под микроскопом. Чашки закрывают, переворачивают вверх дном, подписывают специальным карандашом и ставят в термостат при оптимальной температуре (37 °С) на 18-48 часов. Цель этапа – получить изолированные колонии микроорганизмов.

На второй день (2 этап исследования) на поверхности плотной питательной среды микроорганизмы образуют сплошной, густой рост или изолированные колонии. Колония – это видимые невооруженным глазом скопления бактерий на поверхности или в толще питательной среды. Структуру колоний исследуют в проходном свете при малом увеличении микроскопа.

Характеристика колоний – важна составная часть работы бактериолога и лаборанта, ведь микроорганизмам каждого вида присущи свои особенные колонии.

На третий день (3 этап исследования) изучают характер роста чистой культуры микроорганизмов и проводят ее идентификацию.

Бактериологический метод заключается в выделении чистой культуры возбудителя (популяции, содержащей бактерии одного вида) и идентификации этого возбудителя является основным методом бактериологического исследования

Рост и размножение бактерий. Характер роста на жидких и плотных питательных средах. Методы изучения сахаролитических и протеолитических свойств бактерий. Состав и назначение сред Гисса.

Жизнедеятельность бактерий характеризуется ростом — фор­мированием структурно-функциональных компонентов клетки и увеличением самой бактериальной клетки, а также размноже­нием — самовоспроизведением, приводящим к увеличению ко­личества бактериальных клеток в популяции.

Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Актиномицеты, как и грибы, могут раз­множаться спорами. Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтези­рующихся перегородок деления внутрь клетки, а грамотрицательные — путем перетяжки, в результате образования гантелевид-ных фигур, из которых образуются две одинаковые клетки.

Размножение бактерий в жидкой питательной среде.

Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питатель­ной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит в дальнейшем к истощению питательной среды и пре­кращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой си­стеме называют периодическим культивированием, а культуру — периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивиро­вание называется непрерывным, а культура — непрерывной.

При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузный или поверхностный (в виде пленки) рост культуры.

На плотных питательных средах бактерии образуют скопления клеток, называемые колониями. Внешний вид ко­лоний у многих бактерий настолько характерен, что может слу­жить одним из дифференциальных признаков для их идентифика­ции

Совокупность сахаролитических, протеолитических и других ферментативных свойств бактерий называется биохимическими свойствами бактерий.

Для определения сахаролитических свойств используются среды: плотные среды Эндо, Левина и Плоскирева,а такжежидкие и полужидкие среды Гисса.

Среды Эндо, Левина, Плоскирева содержат лактозу и определенный индикатор.

Эти среды позволяют отличить патогенные бактерии от кишечной палочки - E. coli. E. coli способна расщеплять лактозу, т.к. имеет фермент галактозидазу. При расщеплении лактозы образуются кислые продукты, которые изменяют цвет индикатора. Поэтому E. coli образует на средах окрашенные колонии: на среде Эндо - красные колонии с металлическим блеском; на среде Левина – темно-синие колонии; на среде Плоскирева – красные колонии. Сальмонеллы и шигеллы не имеют фермента галактозидазу, они не расщепляют лактозу, и цвет среды не изменяется. Поэтому сальмонеллы и шигеллы образуют на средах Эндо, Левина и Плоскирева бесцветные колонии.

Таким образом, на одной и той же среде наблюдается различный характер роста разных видов бактерий, т.к. они имеют различные ферменты. Это позволяет отличить один вид от другого.

Среды Гисса содержат лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу и маннит и различные индикаторы. Если бактерии расщепляют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды, а если до кислоты и газа – наблюдают появление газообразных продуктов.

Жидкие среды Гисса состоят из пептонной воды, 1 % углевода и индикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). В среду опускается поплавок, который при стерилизации заполняется средой. Исходный цвет среды – соломенно-желтый. При расщеплении углевода цвет среды становится ярко-розовым (красным). Если образуется газ, он накапливается в поплавке. Если углевод не расщепляется, цвет среды не изменяется.

Полужидкие среды Гисса состоят из 0,2-0,5 % мясо-пептонного агара (МПА), 1 % углевода и индикатора ВР (водно-голубая краска и розоловая кислота). Исходный цвет среды - розовато-серый. При расщеплении углевода цвет среды становится голубым, а если образуется газ, наблюдаются разрывы в среде.

Дата добавления: 2015-08-17