Читайте также:
|
Задача настоящей работы состоит в практическом овладении навыками регистрации спектров поглощения неоднородных объектов (на примере сухих гемоглобиновых пленок) и освоении метода расчета относительной массы хромофора в них.
Приборы и принадлежности:
Задание. Регистрация спектров поглощения сухих гемоглобиновых пятен
1. Включить спектрофотометр. Схема прибора приведена на рис. 1. Включение осуществляется путем последовательного включения входящих в него блоков: (1) общего источника питания всей установки, стабилизатора напряжения; (2) источника питания лампы накаливания (тумблер включения расположен на левой боковой панели внизу); (3) рН-метра ОР-211 (кнопка включения расположена на задней панели, рН-метр используется в режиме милливольтметра и служит для регистрации электрических сигналов фотодетектора) и (4) источника питания фотодетектора (ФЭУ-38, сетевой тумблер расположен на передней панели слева внизу). Обратите внимание на то, чтобы на приборах светились индикаторные лампы, указывающие на факт их включения. Показания рН-метра при закрытой шторке кюветного отделения и включенном источнике питания ФЭУ должны быть равны 0. Если они отличны от 0, следует компенсировать фоновый сигнал регулировочной ручкой «STD1» на передней панели прибора.
2. Приготовить образцы. Для подготовки образцов на имеющиеся стеклянные пластинки наносится цельная крови или эритроцитарный осадок (гематокрит около 80%). На первую из пластинок строго по центру наносится 0,02 мл крови или эритроцитарного осадка, на вторую – 0,04 мл, на третью – 0,06 мл. Поскольку предполагается, что количество гемоглобина в единице объема крови или эритроцитарного осадка – величина постоянная, соотношение масс оксигемоглобина в полученных образцах будет составлять 1:2:3. С помощью острого предмета, например, простого, хорошо заточенного, карандаша, нанесенная кровь или эритроцитарный осадок осторожно распределяются по поверхности пластины с тем, чтобы получить пятна строго круглой формы диаметром 10-15 мм. Пластины с нанесенным гемоглобином подсушиваются до такой степени, чтобы при вертикальном положении пластинки нанесенная капля не стекала. Не рекомендуется готовить все три образца одновременно – при пересушивании часть гемоглобина из пятна может осыпаться. Лучше всего каждый последующий образец готовить незадолго до окончания измерения спектра поглощения предыдущего. Диаметры всех пятен регистрируются, поскольку знание их площади (в см2) необходимо для расчета относительной массы гемоглобина (см. «Теоретическое введение»).
3. Измерить спектры поглощения пятен гемоглобина в спектральной области 400-700 нм. Для этого пластину с пятном гемоглобина установить в кюветодержатель и закрепить ее там прижимной пружиной. Кюветодержатель с образцом установить в выходную апертуру кюветного отделения спектрофотометра. Внимание: Шторка фотодетектора в момент открытия крышки кюветного отделения должна быть закрыта. Несоблюдение этого требования может вывести фотодетектор из строя! Настроить монохроматор спектрофотометра на длину волны тестирующего излучения 580 нм. Открыть выходную щель монохроматора до максимума. С помощью ручки регулировки ширины ирисовой диафрагмы и винтов регулировки положения тестирующего светового зонда добиться максимального совпадения границ гемоглобинового пятна и светового зонда. По достижении этого извлечь кюветодержатель из выходной апертуры кюветного отделения, извлечь пластину с гемоглобиновым пятном из кюветодержателя, а «пустой» кюветодержатель вернуть в кюветное отделение на прежнее место. Закрыть кюветное отделение и светоизолировать его с помощью дополнительного тканевого покрытия. Открыть шторку фотодетектора. Постепенно уменьшая ширину выходной щели монохроматора (регулировочная ручка расположена на монохроматоре наверху справа, под окошком с указателем текущей ширины выходной щели), добиться того, чтобы величина регистрируемого фотосигнала составляла 1000 мВ. Поскольку по схеме включения ФЭУ «+» подан на «землю», фотосигнал регистрируется рН-метром (милливольтметром) как «минус милливольты», и на «минус» перед цифрой на шкале прибора не следует обращать внимания. Перенастроить монохроматор на 400 нм (ручка настройки пропускаемой длины волны расположена слева по центру панели прибора) и замерить величину фонового сигнала как функцию длины волны тестирующего излучения. Шаг измерений: в области 400-440 нм – 2 нм; в области 440-520 нм – 5 нм; в области 520-590 нм – 2 нм; 590-700 нм – 10 нм. Измерение фонового сигнала необходимо для того, чтобы имелась возможность расчета в дальнейшем величины оптической плотности исследуемых гемоглобиновых пятен, поскольку этот расчет требует знания двух значений световых потоков на каждой из длин волн тестирующего излучения, J и J0, т.е. потока света через хромофор и потока света без него (фонового). Напомним, что оптическая плотность D по определению есть lg(J0/J). Окончив измерения зависимости J0=f(l), закрыть шторку фотодетектора, открыть кюветное отделение, извлечь кюветодержатель, возвратить пластинку с гемоглобиновым пятном в кюветодержатель, а его – в кюветное отделение. Поскольку достаточно часто гемоглобиновое пятно бывает расположено на стеклянной пластинке не точно по центру, требуется проверить, насколько хорошо его границы совпадают с границами светового зонда. Для этого, предварительно записав ширину выходной щели, на которой регистрировались величины J0=f(l), открыть эту щель и настроить монохроматор на зеленое излучение. Если из-за эксцентричного положения пятна оно выходит за пределы светового зонда, следует повторно добиться его «вписывания» в световой пучок, поворачивая кюветодержатель в отверстии выходной апертуры. Обратите внимание: Изменять положение светового зонда на образце и ширину ирисовой диафрагмы в этот момент уже нельзя! По достижении максимально возможного «вписывания» гемоглобинового пятна в световой зонд закрыть крышку кюветного отделения, светоизолировать его, вернуть ширину выходной щели монохроматора к той величине, которую она имела во время измерения J0=f(l), настроить монохроматор на 400 нм и измерить зависимость J=f(l). Измерения проводятся на тех же длинах волн, где регистрировалась величина J0. Закончив измерения, пластину с гемоглобиновым пятном поместить в стеклянный стаканчик и залить 4 мл дистиллированной воды. Последовательность действий при измерении спектров поглощения следующих образцов уже не требует повторного измерения J0=f(l), но необходимо настроить спектрофотометр таким образом, чтобы эта зависимость была такой же, как уже измеренная. Для этого новый образец помещается в кюветодержатель, который устанавливается в кюветное отделение. Затем монохроматор настраивается на длину волны 580 нм, его выходная щель максимально раскрывается, и выполняется «вписывание» нового пятна в световой зонд. Затем пластина с пятном извлекается из кюветодержателя, который возвращается в кюветное отделение. Крышка кюветного отделения закрывается, оно дополнительно светоизолируется. После открывания шторки фотодетектора путем постепенного закрывания выходной щели монохроматора сигнал фотодетектора доводится до 1000 мВ. Ширина щели, при которой это будет достигнуто, скорее всего, будет отличаться от той, при которой проводились измерения спектра поглощения первого образца, поскольку трудно добиться точного совпадения площадей тестируемых гемоглобиновых пятен в разных образцах. Далее измерения проводятся также, как и при анализе зависимости J=f(l) для первого пятна. Единственное отличие – ширина выходной щели монохроматора во время измерений должна быть другой, такой, чтобы величина J0 при 580 нм составляла 1000 условных единиц, несмотря на изменившуюся площадь поперечного сечения светового зонда.
4. Построить спектры поглощения оксигемоглобина в сухих пленках. Зная величины J и J0 при каждой из длин волн тестирующего излучения, рассчитать соответствующие величины оптической плотности и построить спектры поглощения всех 3 исследованных гемоглобиновых пятен с помощью программы «Micsoft Exel».
5. Рассчитать относительные массы гемоглобина в сухих пленках. Расчет проводится согласно методике, описанной в теоретическом введении (см. выше).
6. Определить отношения масс гемоглобина в смывах сухих пятен. Смыть гемоглобиновые пятна со стеклянных пластинок 4 мл дистиллированной воды (каждое из пятен смывается по отдельности). Измерить оптические плотности смывов при 578 и 620 нм на спектрофотометре СФ-46 (работа №3). Как показатель относительной массы гемоглобина в смыве используется величина DD = D578-D620. Соотношение DD в трех исследованных образцах наиболее точно отражает истинное соотношение содержаний в них гемоглобина.
7. Требования к представляемым результатам. В отчете по работе должны содержаться (1) спектры поглощения сухих пленок гемоглобина и (2) таблица с величинами соотношения количества гемоглобина в образцах, определенными 2 способами: по сухим пленкам и по смывам этих пленок. В выводе следует указать (если это наблюдается), почему относительные массы, определенные разными способами, отличаются друг от друга и от исходного соотношения (1:2:3).
Приложение
Таблица для перевода величины Q в величину q
Дата добавления: 2015-07-25; просмотров: 51 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая страница | | | следующая страница ==> |
| Определение количества вещества в неоднородных объектах методом фотометрирования при двух длинах волн. | | | Способы измерения величины рассеивания оптического излучения |