Практическая часть

Задача настоящей работы состоит в практическом овладении навыками регистрации спектров поглощения биологических объектов и изучение методов анализа биологических объектов с помощью производной и дифференциальной (разностной) спектрофотометрии.

Приборы и принадлежности:

1. Спектрофотометр СФ-14
2. Приставка к спектрофотометру для записи производных спектров поглощения
3. Стеклянные кюветы толщиной 5 мм – 2 шт.
4. Эритроциты кролика
5. Перманганат калия
6. Тиосульфит натрия

Задание 1. Регистрация производных спектров поглощения водных растворов гемоглобина и перманганата калия

Метод производной спектрофотометрии состоит в регистрации первой и/или второй производной спектров поглощения по длине волны.

В данной работе применен непрямой метод регистрации производных спек-тров поглощения. Для его реализации параллельно направляющим, по которым двигается регистрирующее перо спектрофотометра, установлен проволочный реостат, а на пере спектрофотометра закреплен замыкающий ветви реостата скользящий контакт. При смещении пера спектрофотометра (величина которого прямо пропорциональна оптической плотности измеряемого образца) изменяется и величина сопротивления реостата, а, следовательно, падение напряжения на нем. Полученный с реостата переменный электрический сигнал поступает на рН-метр ЛПУ-01, работающий в данном случае в качестве усилителя постоянного тока. С выхода рН-метра сигнал либо регистрируется в аналоговой форме с помощью регистрирующего потенциометра (самописца) ЭПП-09, либо трансформируется в цифровую форму и регистрируется с помощью персонального компьютера. В последнем случае спектр регистрируется программой «PC-recorder» и сохраняется как файл программы «Microsoft Exсel» (Подробнее см. описание программы «PC-recorder».) При цифровой регистрации спектров можно ограничиться измерением только исходного спектра поглощения, а его 1-ю и 2-ю производные получить расчетным путем непосредственно в программе «Microsoft Exсel».

Порядок регистрации спектров поглощения и их производных

1. Включить питание спектрофотометра СФ-14 (тумблер «Сеть» на его панели управления). При включении питания должен одновременно заработать мотор прерывателя (модулятора) спектрофотометра. Если мотор не включился, включить его тумблером «Прерыватель». Не желательно выключать мотор прерывателя до окончания проведения измерений, т.к. это может изменить полярность регистрируемого сигнала случайным образом.
2. Установить в кюветное отделение спектрофотометра кюветодержатели с закрепленными в них кюветами с образцом (левое положение) и контролем. Следует обратить внимание на то, чтобы кюветодержатели разместились точно на предназначенных для них направляющих рельсах в кюветном отделении. Объем растворов в кюветах должен быть таков, чтобы верхний мениск жидкости не попадал в тестирующий световой пучок. В кювете не должны присутствовать пузырьки воздуха, посторонние примеси и загрязнения. Загрязненные кюветы перед использование следует тщательно вымыть и просушить.
3. Закрыть кюветное отделении прибора, улучшить его светоизоляцию с помощью специальной светонепроницаемой ткани.
4. Включить источник излучения спектрофотометра (тумблер «Лампа»). Установить рукоятью ручной развертки исходную длину волну измерения (460 нм). Установленная длина волны индицируется на барабане спектрофотометра, справа от направляющих пера самописца прибора. Источник излучения в данном приборе имеет ограниченный срок службы, поэтому его следует включать только на время настройки прибора и записи спектров поглощения.
5. Включить фотодетектор спектрофотометра (тумблер «Отработка»). Перо самописца спектрофотометра должно прийти в движение и занять некоторое положение на направляющих. Перо не должно уходить за пределы предназначенной ему шкалы. При уходе пера за пределы шкалы можно попробовать изменить полярность сигнала фотодетектора тумблером «Изменение направления». Если это не помогает, причиной является либо неправильное расположение кювет, либо проход части тестирующего пучка мимо образцов, либо наличие загрязнений в кюветах, либо неправильно выбранная длина волны изменения.
6. Если перо самописца спектрофотометра не вышло за пределы шкалы измерения, следует медленно провернуть рукоять ручной развертки спектра в сторону увеличения длины волны на 100-150 нм. Перемещения пера самописца вправо-влево по направляющим указывают на нормальную работу спектрофотометра. Верните длину волны тестирующего излучения обратно к началу предполагаемого диапазона регистрации спектра.
7. На приставке для получения производных спектров установите переключатель «Выбор режима» в положение «D». Переменное сопротивление, регулирующее усиление сигнала в этом режиме, установите в среднее положение. Включите тумблеры «Питание реохорда» и «Вход рН-метра». Если предполагается запись спектра в цифровой форме, включите компьютер и запустите программу “PC-recorder”. Работа с программой описана в соответствующем приложении.
8. Запуск записи спектра осуществляется тумблером «Развертка» на панели спектрофотометра и одновременным нажатием кнопки «Пуск» в меню “PC-recorder” или включением тумблера «Диаграмма» на самописце. Для отметки длин волн на записи предусмотрена рейперная кнопка, расположенная рядом с управляющей панелью спектрофотометра. Для отметки длины волны нужно кратковременно (на 0,2-0,5 с) нажать эту кнопку. Для внесения меток при записи спектра с помощью программы “PC-recorder” при включении соответствующего режима (наличии «флажка» в окошке «Режим меток») следует кратковременно нажимать правую кнопку мыши.
9. По окончании записи спектра остановите его развертку и выключите фотодетектор и лампу спектрофотометра. При включенном фотодетекторе открывать кюветное отделение запрещено! Не забудьте сохранить записанный в «PC-recorder» файл в форме файла «Microsoft Exсel» (см. описание работы с программой «PC-recorder»). Несохраненные данные теряются, и проведенное измерение необходимо будет повторять. При работе с самописцем – выключите тумблер «Диаграмма».
10. Переключите переключатель режимов на дифференцирующей приставки в положение «D^’». Установите регулятор чувствительности регистрации для этого режима приставки в среднее положение. Вручную верните начальную длину волны регистрируемого спектра на монохроматоре. Включите лампу и фотодетектор спектрофотометра. Включите развертку спектра на некоторое время. Если амплитуды максимумов и минимумов записываемой зависимости будут недостаточно выражены, выключите развертку, лампу и фотодетектор, верните длину волны начала регистрации спектра и несколько увеличьте усиление соответствующим регулировочным сопротивлением на приставке. Повторите пробную запись производной спектра. Эти действия нужно повторять до тех пор, пока амплитуды регистрируемых полос не будут составлять около 2/3 размаха шкалы измерения.
11. Аналогичным образом регистрируется и зависимость D^” = f(l).

Задания работы:

1. Зарегистрировать спектр поглощения, а также его первую и вторую производные (в спектральном диапазоне 460-610 нм) для

1.1. Водного раствора оксигемоглобина, полученного путем гемолиза небольшой порции эритроцитарной суспензии в дистиллированной воде. Концентрация оксигемоглобина в образце подбирается экспериментально таким образом, чтобы в максимумах спектра поглощения отклонение пера спектрофотометра составляло около 2/3 размаха шкалы прибора.

1.2. Водного раствора перманганата калия. (в этом же спектральном диапазоне).

2. По полученным спектрам построить зависимости амплитуд максимумов и минимумов на D’=f(l) как функции тангенсов угла наклона касательных к зависимости D = f(l) в точках перегибов (т.е. в точках максимумов и минимумов напроизводной) По полученному графику определить константу пропорциональности между истинным и измеряемым значениями производных.

3. Определить и сопоставит величины полуширин полос поглощения на исходных спектрах и на их вторых производных.

Разностная (дифференциальная) спектрофотометрия

При работе с биологическими объектами часто бывает необходимым выявлять относительно небольшие изменения в оптической плотности объекта на фоне неизменного и сильного общего поглощения света в нем. Для решения этой задачи широко применяется метод разностной спектрофотометрии. Суть этого метода состоит в том, что на спектрофотометре измеряется не абсолютная оптическая плотность исследуемого образца (D_и), а разность (D_р) между оптической плотностью стандартного образца (D_ст) и D_и, причем исследуемый образец получают из стандартного, оказывая на него специфическое модифицирующее воздействие (например, окисляя или восстанавливая определенные хромофорные группы, меняя их заряд и т.д.).

Задание работы

Методом разностной спектрофотометрии показать исчезновение характерной полосы поглощения при 550 нм перманганата калия при его окислении тиосульфитом натрия. Поскольку метод разностной спектрофотометрии (см. выше) не требует регистрации производных, все измерения при выполнении этого задания проводятся только в режиме «D». Для получения разностного спектра необходимо сначала зарегистрировать «нулевую» линию – спектр, отражающий различия в толщинах кювет и концентраций перманганата калия в кюветах с «образцом» и «контролем». Для этого в обе кюветы помещается одинаковый водный раствор перманганата, и производится регистрация спектра поглощения в спектральном диапазоне 460-610 нм. Полученный спектр не должен представлять из себя идеальную прямую – это означает, что прибор не регистрирует различий в оптической плотности, каковые всегда имеются из-за небольших различий в толщине кювет и концентраций растворов у опытного и контрольного объектов. После регистрации «нулевой» линии непосредственно в «контрольную» кювету вводятся 1-2 кристаллика тиосульфита натрия, полностью растворяются в ней, и запись спектра повторяется. При правильном выполнении задания при повторной регистрации спектра на нем появляется ранее отсутствовавшая полоса поглощения при 540 нм. В окончательном виде разностный спектр вычисляется путем вычитания из последнего измеренного спектра «нулевой» линии.

Отчет и выводы

В отчете по работе должны содержаться:

1. Спектр поглощения оксигемоглобина, первая и вторая производные этого спектра.

2. Спектр поглощения водного раствора KMnO₄, первая и вторая производные этого спектра.

3. Разностный спектр поглощения окисленной и восстановленной форм KMnO₄.

4. Зависимости амплитуд максимумов и минимумов на D’=f(l) как функции тангенсов угла наклона касательных к зависимости D = f(l) в точках перегибов (т.е. в точках максимумов и минимумов на производной).

5. Величины констант пропорциональности между истинным и измеряемым значениями производных.

6. Величины полуширин полос поглощения на спектрах оксигемоглобина и KMnO₄ и их вторых производных с указанием соотношений этих полуширин.

В выводах обсуждается следующее:

1. Какой метод регистрации производных спектров поглощения используется в данной работе? Обосновать заключение полученными результатами.
2. Приводит ли регистрация второй производной спектра поглощения к увеличению разрешения полос поглощения? Почему? Во сколько раз в среднем падает полуширина полос поглощения на второй производной спектра в сравнении с ее исходным значением?
3. Позволяет ли регистрация разностного спектра увидеть ранее отсутствовавшие максимумы поглощения? При какой длине волны расположен в Вашем случае этот максимум?

Отчет должен содержать следующее:

1. Название работы
2. Краткое теоретическое введение с описанием биофизических основ применяемых при выполнении методов.
3. Подробное описание хода проведения измерений и обсчета данных (включающее в себя описания всех проводившихся черновых расчетов, их промежуточные и конечные результаты).
4. Полученные окончательные результаты (преимущественно в виде таблиц и графиков, оформляемых в соответствии с требованиями журнала «Биофизика»).
5. Выводы с элементом обсуждения, в которых не просто констатируется факт получения того или иного результата, но и объясняются связи между полученными данными и общими закономерностями, приведшими к их получению.

Дата добавления: 2015-07-25