Воздействия на объект, снижающие величину светорассеивания в нём

Поскольку основной причиной возникновения светорассеивания является оптическая неоднородность объекта, ослабить рассеивание света в нем возможно путем её устранения. Достичь этого можно либо изменив коэффициент преломления света в оптических неоднородностях (n_ч), добиваясь того, чтобы он стал равен среднему по образцу, либо изменив средний коэффициент преломления образца (n), с тем, чтобы он стал равен n_ч.

Рассмотрим, как это достигается, на примере клеточной суспензии, наиболее распространенного светорассеивающего биологического объекта.

Как уже указывалось, оптическими неоднородностями в суспензии клеток в водной среде оказываются сами клетки. Для того, чтобы сделать такую суспензию немутной (т.е. ослабить или устранить светорассеивание в ней) необходимо либо (1) сделать коэффициент преломления клеточной цитоплазмы равным коэффициенту преломления водной среды инкубации, либо (2) подобрать такую среду инкубации, у которой коэффициент преломления был бы близок к величине этого показателя у цитоплазмы исследуемых клеток.

Технически гораздо проще реализовать первый из упомянутых методов. Для этого достаточно тем или иным способом лизировать находящиеся в образце клетки. Оптические неоднородности при этом исчезают, и объект перестает рассеивать свет. Например, при гемолизе (выходе гемоглобина из эритроцитов в среду инкубации) ранее мутная эритроцитарная суспензия становиться прозрачной, т.е. перестает рассеивать свет. К несчастью, лизис клеток обычно сильно влияет на состояние их компонентов, многие из которых теряют свою нативность. Естественно, лизированные клетки функционально неактивны. Поэтому данный метод устранения светорассеивания в клеточных суспензиях применяется достаточно редко.

Второй метод ослабления светорассеивания в клеточных суспензиях более трудоёмок. Для того, чтобы его реализовать, клетки помещаются в специальные среды с коэффициентом преломления, близким к таковому у их цитоплазмы. Для большинства клеток такими средами являются насыщенные растворы белка (например, сывороточного альбумина) и водно-глицериновые смеси. Концентрация белка в белковой среде или концентрация глицерина в водно-глицериновой смеси подбираются индивидуально, в зависимости от типа исследуемых клеток. К сожалению, оба типа сред инкубации, в которых клетки рассеивают свет слабо, не лишены недостатков. Для белковых сред чаще всего применяются сывороточные альбумины. Но эти белки содержат в своей полипептидной цепи ароматические аминокислотные остатки (в сывороточном альбумине человека имеется 2 триптофановых остатка и 18 – тирозиновых), из-за чего их растворы обладают сильным собственным поглощением в ультрафиолетовой части спектра. Естественно, это делает невозможным применение сред на основе сывороточных альбуминов для спектрофотометрии в этом спектральном диапазоне. С другой стороны, инкубация клеток в средах на основе водно-глицериновых смесей не всегда благоприятно сказываются на их выживаемости и функциональной активности.

В любом случае, путем простой замены среды инкубации полностью устранить светорассеивание в клеточной суспензии обычно не удается. Связано это с тем, что, во-первых, в большинстве клеток, помимо цитоплазмы, имеются многочисленные органеллы, коэффициент преломления света в которых может сильно отличаться цитоплазматического, а, во-вторых, даже коэффициент преломления цитоплазмы у отдельных индивидуальных клеток в образце неодинаков.

Поэтому, даже после исключения многократного светорассеивания и ослабления светорассеивания однократного, лучше всего исследовать спектры поглощения клеточных суспензий на спектрофотометрах, снабженных специальными устройствами, позволяющими правильно определять величину истинной оптической плотности мутных объектов.

Дата добавления: 2015-07-25