Ан сарысуында цитокиндер өнімдерінің құрамын анықтау.

Қанның моноциттерімен және лимфоциттерінің негізгі қызметі цитокиндерді өндіру және өндіру болып табылады. Цитокиндер – жасушааралық коммуникацияда және дегемопоэзде жасушалардың өсуі және дифференциялануы, иммунды хабарлы жасушалардың эффекторлық және реттегіш қызметтері сияқты бірқатар биологиялық қызметті ортақтастыратын иммундық жүйенің реттегіш нәруыздары.

Бүгінгі күнде цитокиндер деңгейін бағалауда ең тиімдісі иммунды ферменттік әдістер болып табылады. Әр түрлі патологияда жергілікті және жүйелі деңгейлерде цитокинді статусты бағалауға арналған диагностикалық иммунды ферменттік сынама-жүйелерін қолдану, аурудың патогенезінің түсініктемесінде қосымша болып табылады. Қан лимфоциттері және моноциттердің цитокиндерді өндіру (интерлейкиндер, инферондар) қабілетінің бағасын соңғы уақытта олардың функционалдық жарамдығын тексеруде жиі қолданады.

Әдістің қағидасы. Спонтанды өнімдерінің ИЛ1β, ИЛ-1-РА, ИЛ-2, ИЛ-4, ИФγ және ИФα анықтауға арналған әдістің сезімталдығы ИЛ1β үшін -6,25 пг/мл, ИЛ-1-РА үшін – 50 пг/мл, ИЛ-4 және ИЛ-2 үшін – 5пг/мл, ИФγ және ИФα үшін 15 пг/мл құрайды. Қатты фазалық иммунды ферменттік талдау әдісі қатты фазада (иммунды ферменттік талдауға арналған 96 лункалық плат) кешендердің құруымен негізделген. Ол кешендер: 1) ерітіндідегі цитокиндермен байланысты тышқанның моноклонды антиденелерінен; 2) цитокиннен; 3) цитокиндерге қоян поликлонды антиденелерінен; 4) қоян иммуноглобулиндерге ешкі антиденелері бар хрен пероксидазасының конъюгатасынан тұрады.

Платтарға керек реагнеттерді енгізген кезде кешен қалыптасады. Аспирация және платты жуу арқылы артық реагенттерді жояды. Хромоген ерітіндісі қосылғаннан кейін, әр лункада байланысқан конъюгат мөлшеріндегі боялу жиілігін анықтауда хромоген ерітіндісін әрбір лункаға қосқанда білеміз. Талдаудың нәтижесі калибрлі кесте арқылы анықталады. Ол фотометрде ИФТ-мен сәулелі фильтрдегі 492нм оптикалық тығыздықты анықтау.

IL-2. Дақылдық сұйықтықта және қан сарысуында болуын 20-дан 1000 пг/мл дейін (1 пг=10^-12г) концентрация интервалында анықталады. IL-2 митоген немесе антигенмен белсендірілген Т-лимфоциттермен өндірілетін, гликопротеин болып табылады. IL-2 иммунды жауаптың дамуында маңызды рөл атқарады. IL-2 төменгі деңгейі әр түрлі ауруларда: склерозда, склеродермияда, ревматоидтық артритте, инсулинге тәуелді диабетте, жүйелі қызыл жегі және т.б. байқалады.

IL-1-β сарысу және дақылдық сұйықтық үлгісінде 6,3-тен 400 пкг/мл дейін (ООО «Цитокин») концентрация диапозонында анықталады. IL-1β негізгі көзі моноциттер, макрофагтар және дендритті жасушалар болып табылады. IL-1α-дан айырмашылығы IL-1β ерігіш формасы түрінде кездеседі. IL-1β рекомбинантты түрінің айқын иммунды тапшылықты емдеуде және гемопоэзді қалпына келтіру кезінде клиникалық тәжірибеде қолданады.

IL-1RA (IL-1 рецепторлық антагонисті). Дені сау донордың сарысуында 350-ден 700 пг/мл дейін болады. Макрофагтармен, моноциттермен, нейтрофилдермен, фибробласттармен және эпителий жасушаларымен өндіріледі. IL-1RA IL-1α және IL-1β биологиялық белсенділігін тежеу арқылы олардың рецептормен байланысуында жарысады. Адам қанында IL-1RA концентрациясын анықтау сепсис, ревматоидтық артрит, демікпе және қабыну аурулары кезінде диагностикалық және болжамдық мағынасы бар.

IL-4 белсендірілген Т-лимфоциттермен өндіріледі. IL-4 В-лимфоциттердің, сүйек кемігіндегі ізашар жасушаларының және мес жасушаларының пролиферациясын белсендіреді. IL-4 бірқатар беткей антигендердің экспрессиясын шақырады және цитофилді иммуноглобулиндердің өнімдерін белсендіреді. Оның көптеген биологиялық қызметтері, гуморалдық иммундық жауапты реттейді. Оның көптеген биологиялық қызметтеріне, гуморалдық иммундық жауапты IgE өнімдеріне және реттейтін Т-хелпердің субпопуляциясының Th2 стимуляциясына плазмалық жасушалар түзетін иммуноглобулиндердің өнімдеріне ауысуының индукциясы жатады. IL-4 сонымен қатар айқын ісікке қарсы белсенділігіне ие болады.

IL-8 әр түрлі ынталандырушыға, эндотоксин, IL-1, TNF-α және вирустарға жауап ретінде мононуклеарлы фагоциттермен, полиморфтыядролық лейкоциттермен, эндотелий жасушалармен және әртүрлі мезотелиалды тип жасушаларымен өндіріледі. IL-8 біріншілік қызметі – қабыну жерлерінде нейтрофилдің белсенділігі және хемотаксисі. Қазіргі уақытта жарақатты емдеуде IL-8 негізіндегі препараттарды сынаудан өткізуде.

Интерферон-α вирусты жұқпалардан ағзаның арнайы емес қорғаныстың негізгі элементтерінің бірі болып табылады. Интерферон-α моноцитарлы-макрофагалды қатардағы жасушалармен түзіледі. Барлық жасушаларды қажетті тұрғыда белсендіретін болсақ, олар IFN-α өндіруі мүмкін. Бірақ IFN-α ең көп санын дендриттік жасушалардың ізашарлары өндіреді. Қалыпты жағдайда қан сарысуында альфа-интерферонның деңгейі біршама аз және ол бірнеше бірлікті құрайды: 5-50 пкг 1 мл сарысуда. IFN-α түзілуінің негізгі индукторы көптеген вирустар және олардың өнімдері, оның ішінде маңызды орын алатын екітізбектік РНК болып табылады. IFN-α биологиялық қызметі вирусты жұқпаларға және ісік өсуінің тежеуіне бағытталған. IFN-α негізіндегі препараттарды клиникалық тәжірибеде белсенді түрде қолданады.

IFN-γ Т-лимфоциттермен және табиғи киллермен өндіріледі. Макрофагтардың сонымен қатар табиғи киллердің, микробқа және ісікке қарсы in vitro және in vivo белсендігін күшейтеді. IFN-γ МНС ІІ класс молекуласының экспрессиясын белсендіреді. IFN-γ В-жасушалардың дифференциялануы және активациясының кофакторы, сонымен бірге IL-4 функционалдық антагонисті болып табылады.

TNF-α. Көптеген ынталандыруға: митогендерге, цитокиндерге, бактерияларға, вирустарға және паразиттерге жауап ретінде, макрофагтар TNF-α негізгі өндіретін жасушалар болып табылады. Ісікке қарсы белсенділігінің болуына қарамастан, TNFα иммунды жауаптың, қабынудың және гемопоэз модуляциясында маңызды рөл атқарады; ісікке қарсы иммунитетке қатысады, TNFα өнімі артық болған кезде анорексия, кахексия, септикалық шок шақырады.

Моноклонды антиденелер

1974-1975 жж. Г.Келлер және У.Мильштейн біреуі – ісіктік (миеломды жасуша), екіншісі – қалыпты лимфоциттен тұратын, біріккен екі жасушадан алынған гибридті жасушаларды алу үшін әдістеме шығарған. Алынатын гибридті жасушалар қалыпты лимфоциттер (геномы тұрақтанбағанша, хромосоманың басқа бір бөлігі алғашқы бөліну кезінде жасушалардан шығарып тасталады) хромосоманың бір бөлігі (сонымен қатар, қасиетін) және ісік жасушаларының бір бөлігі болады. Тек қана шексіз бөлінетін жасушалар өзін-өзі клондауға «рұқсат етеді», яғни физикалық түрде бір-бірлеп «жайғастырады» (әрқайсысын жеке ыдысқа) және бір жасушадан тараған ұрпақ – жасушалар клонын алады. Бұл жасушаларды – гибридомдар деп атаған. Осы жасушаларда қалыпты лимфоциттердің өнімдері, көбінесе, антиденелердің биосинтезі жүреді.

Гибридом жасушаларымен өндірілетін антиденелерді моноклонды антиденелер деп атайды. Олар жеке нәруыздарға қарсы бағытталған (қарастырылатын жағдайда лейкоциттердің жасушалық мембранасының компоненттері) және тек осы нәруыздармен байланысатын антиденелер болып табылады. Осындай антиденелер белгілермен, мысалы, арнайы Т-жасушалық нәруыздарға қарсы, тек Т-лимфоциттер ғана жарқырау қабілетіне ие болады. Осындай жасушалардың санын люминесцентті микроскоп арқылы анықтауға болады. Сондау зерттеулерді автоматизациялау үшін – жасушалардың флуоресценттік анализаторы, немесе ағымды цитофлуориметр деп аталатын арнайы құрал жасалған.

Люминесценцияны қоздыратын күн сәулесі түскен жіңішке капиллярлар арқылы жасушалар тоқтаусыз өтеді. Әрбір жарқырайтын жасуша арнайы детектор арқылы импульс ретінде тіркеледі. Құрал автоматты түрде хабарды өңдеп, гистограмма ретінде – әртүрлі жарқырау қарұындығын бар жасушалардың таралу графигінің нәтижелерін береді. Моноклонды антиденелердің көп жиынтығын пайдалана отырып, қанда Т-(CD2⁺, CD3⁺) және В-лимфоциттердің (СD19⁺, CD20⁺, CD22⁺, CD72⁺) cанын ғана емес, сонымен қатар Т-лимфоциттер субпопуляцияларының: Т-хелпердің (CD4⁺) және цитотоксикалық Т-лимфоциттердің (CD8⁺), NK – жасушалардың (CD56⁺, CD16⁺) санын анықтауға болады.

Қазіргі уақытта әр түрлі антигендерге моноклонды антиденелердің (МонАД) көптеген түрлері шығарылған (13 кесте).

13 кесте. Әртүрлі жасушалық рецепторларға арналған моноклонды антиденелер

Антиген	Танушы жасушалар
СD1	Кортикалды тимоциттер
CD3, CD2	Т-лимфоциттер
CD4	Т-хелперлер, моноциттер
CD5	Т-лимфоциттер және В-лимфоциттер
CD7	Т-жасушалар
CD8	Т-супрессорлар/цитотоксикалық Т-лимфоциттер, NK-жасушалары
CD10	Лимфобласттар
CD11b	Комплементтің С3 компонентінің С3bi-рецепторы
CD13	Ерте миелоидты жасушалар
CD14	Гранулоциттер, моноциттер
CD15	Гранулоциттер
CD16	NK-жасушалары, моноциттер, гранулоциттер
CD17	Гранулоциттер, моноциттер, тромбоциттер
CD18	Лейкоциттер
CD20	В-лимфоциттер
CD21	В-лимфоциттер
CD22	В-лимфоциттер
CD24	В-лимфоциттер, гранулоциттер
CD25	Интерлейкин-2 рецепторы
CD45 RA	В-лимфоциттер, Т-лимфоциттер (40%), NK-жасушалары
CD50	Лейкоциттер
CD54 (ICAM-1)	Цитокинмен белсендірілген эндотелий және т.б. жасушалар
CD56 (N-CAM)	NK-жасушалары, кейбір Т-лимфоциттер
CD71	Трансферрин рецепторы
CD72	В-лимфоциттер
CD95 (FAS)	Апоптозға дайын жасушалар маркері (FAS – рецептор)

Моноклонды антиденелердің қолдану аймағы әртүрлі болуы мүмкін, мысалы, қан нәруыздарына, гормондарға, арнайы антиген тіндеріне, мүшелерге, ісік және қалыпты жасушаларға, вирустарға, бактерияларға, паразиттерге, химиялық қосылыстарға және т.б. қарсы антиденелер болуы мүмкін.

Иммунды талдаудың қазіргі кездегі әдістері

Иммундық талдау дегеніміз антигеннің антиденелермен әрекеттесуімен негізделген, ерігіш заттардың сапалық және сандық анықтау әдістері (яғни, иммунологиялық тану). Түзілген антиген-антидене кешені, алдын ала антиденемен немесе антигенмен конъюгацияланған, арнайы белгілер арқылы анықталады. (41-ші сурет).

Құралдар тек қана «көрмейді», сонымен бірге белгілердің санын өлшейді. Белгілер ретінде, белгілі жағдайларда құрал немесе адамның көзі арқылы көрінетін заттар қолданады. Оларға жататындар:

· Радионуклеидтер, бұл жағдайда талдауды радиоиммундық деп атайды (РИТ);

· Түсті немесе флюоресцентті өнімдерді түзу арқылы субстраттың айналуын катализациялайтын ферменттер. Осындай талдауды иммунды ферменттік (ИФТ) немесе, иммунофлюоресцентті деп атайды;

· Флюоресцентті немесе люминесцентті заттар және т.б.

Радиоиммундық талдау әдістері (РИТ) өткен ғасырдың 70-шы жылдарында дайындалған. Бұл әдістер сұйық ортада болатын, төменгі концентрациядағы (нанограммды, кейбір кезде пикограммды санын) әр түрлі қосылыстардың, соның ішінде антиденелердің, антигендердің, цитокиндердің, рецептордың ерігіш түрінің, нәруызды және стероидтық гормондардың және т.б. дәл санын анықтау үшін өте қажет.

РИТ жүйеге енгізілген, антигендерге қарсы арнайы антиденелердің шектелген санына, зерттелетін (белгіленбеген) антигеннің белгіленген антигеннің (антигенді ¹³¹І, ³Н изотопымен белгілейді) қажет санымен бәсекелесу феноменімен негізделген. Зерттелетін сұйықтықта анықталатын антиген көп болса, онда белгіленген антиген антиденелермен аз байланысады. Неғұрлым зерттелетін сұйықтықта анықталатын антиген саны көп болса, соғұрлым аз мөлшерде белгіленген антиген антиденелермен байланысады және де көп мөлшерде ерітіндіде қалады.

Иммунды ферменттік талдау (ИФТ). Бұл әдіс, РИТ-тің қағидасына сәйкес негізделген, тек бұл кезде радиоактивті бегілердің орнына ферментті (хрен пероксидазасы, сілтілі фосфатаза, глюкозидаза) қолданады. Осы ферменттің әсерінен, бояуы өзгерген субстраттың негізінде, серпіліске түскен белгіленген антидене немесе антигеннің саны анықталады. ИФТ сынама-жүйесінің антиденелері (поликлонды және әсіресе моноклонды) үшін аналитикалық нысана ретінде А, М, G, Е иммуноглобулиндері, гормондар (нәруыздық және стероидты табиғаты бар), тасымалдаушы және құрылымдық нәруыздар, липопротеиндер, гликопротеиндер және көптеген басқа да жоғары молекулалық биологиялық қосылыстар болып табылады.

Сезімталдығы және арнайылығы бойынша РИТ және ИФТ ұқсас, себебі, осы көрсеткіштер белгілердің сапалығымен емес, антиденелер және антигендермен анықталады. Бірақ РИТ-ға қарағанда ИФТ кеңінен қолданады, себебі ИФТ үшін реагенттер мәнді:

- Сақтау және тасымалдау кезінде тұрақты;

- РИТ-ға қарағанда қауіпсіз, өйткені РИТ кезіндегі радионуклеидтерді қолданады. Ол үздіксіз сәулелендіреді, және оның радиациялық белсенділігі уақыт өте үздіксіз өзгереді, себебі нәруыздарды белгілеу кезінде радионулидті йод жиі қолданылады, оның ыдырау кезеңі қысқа болады және реагенттерді айына бір рет жаңартып отыру қажет;

- Нәтижені субъективті (микроскопия) арқылы емес, аспап арқылы бақылау (фотометрия). Басқа иммунологиялық әдістермен салыстырғанда, ИФТ-ды қолдана отырып, техника жағынан оңай және тура талдауын көрсетеді. ИФТ-да нәтиженің өндірілуі және өнімділігі жоғары – бір уақытта 96 талдау жүргізуге болады.

ИФТ негізінде екі биологиялық феномен жатыр – антиденелердің жоғары арнайылығы (яғни, байланысқан антиген/эпитопты қатаң басқару қабілеті бар) және химиялық серпілістің ферменттермен көп мәрте күшейту.

Әдісті өңдеу үрдісінде ИФТ-дың гетерологиялық (қатты фазалық) және гомогенді варианттары құралған. Әдістің гомогенді варианты төменгі молекулалық заттарды анықтауға арналған, ол байланысу сипатына қарай, ферменттердің белсенділік айырмашылығын табуға негізделген. Гетерогенді вариантта антиген немесе антиденені қатты фазада иммоболизациялайды. Қатты фаза ретінде жиі қолданылатын пластик. Ол иммунологиялық серпілісте планшеттің лункаларын, қағаз немесе полимерлі пластинка – стрипттерді қолданады. Жұқпалы аурулар диагностикасында қатты фазалық иммунды ферменттік серпілістің қолданылуын жөн көрген.

Бүгінгі күнде барлық қолданылатын иммунологиялық зерттеу әдістері дәрігерлердің тәжірибелік қызметінде қызмет етеді:

· Дені сау және науқас адамдарда иммунды статусын нәтижесін анықтау үшін;

· Науқастың иммундық жүйенің зақымдалу деңгейін анықтау үшін;

· Келесі тексерулерге дейін науқастың екіншілік иммундық тапшылық жағдайының себебін анықтау үшін;

· Иммунитетті реттеу үрдісі кезінде зақымдалған иммунологиялық параметрлердің қалпына келтіруін бақылау үшін;

· Жұқпалы аурулардың сатысын анықтау (жедел сатысын, вирустың белсенді репликация сатысын, созылмалы сатысына ауысуын, созылмалы жұқпалардың өршуін, анық клиникалық симптоматикасы жоқ жасырын жұқпалы патологияны, бұрын жұқпамен ауырған нәтижесінде қан сарысуындағы IgG деңгейінің динамикасымен, егуден кейінгі иммунитет және т.б.) ПТС берілген нәтижесі бойынша (биологиялық материалда антидене және антигеннің болуы) үшін;

· Аллергиялық жағдайлардың дамуында этиологиялық факторларды анықтау (НЗК сынамасы арқылы жұқпаны да, сол сияқты аллергенді) дұрыс диагноз қою мақсатында (жұқпалы, жұқпалы емес немесе аллергиялық патологиялық) және терапияда дұрыс емдеу тактикасын қолдану үшін;

· Генетикалық бөтентекті тіндерді немесе мүшелерді трансплантацияға дайындау және кейін тұрақталуын, қызметін атқаруы бойынша иммунологиялық бақылау жүргізу, иммундық депрессиялық терапияны тағайындау үшін.

Соған байланысты, қазіргі уақытта әртүрлі аурулар кезінде иммунитеттің жасушалық және гуморалды звеносының иммунологиялық көрсеткіштерін, фагоцитоз, комплемент жүйелерінің қызметін, цитокиндердің деңгейін, сонымен бірге ИФТ, ПТС, ИФС, ТИФ, НЗК, РАСТ және басқа да әдістердің нәтижелерін анықтау жүргізілуде. Міндетті түрде, иммунологиялық зерттеу әдістерінің диапазоны кеңейеді және жаңарады.

Дата добавления: 2015-11-30