Экспериментальный протокол для урока 4

1. Выньте вашу микроцентрифужную пробирку из заморозки и оттайте ее в руке. Поместите пробирку в центрифугу и осадите нерастворимый бактериальный дебрис открутив пробирку в течение 10 мин на максимальной скорости. Подпишите вашими инициалами другую микроцентрифужную пробирку.
2. Пока центрифуга крутится, подготовьте колонку для хроматографии. Хорошенько потрясите колонку, чтобы взболтать сорбент, потом резко встряхните ее одним движением, как градусник, чтобы сорбент осел. Для ускорения оседания можно также легко постучать колонкой по столу, как пачкой бумаги. Снимите верхнюю крышку с колонки и отрежьте нижнюю. Дайте всей жидкости вытечь из колонки (это займет ~3-5 минут).

1. Подготовьте колонку, нанеся на нее 2 мл буфера для уравновешивания (порциями по 1 мл хорошо промытой пипеткой). Дайте буферу стечь до отметки 1 мл над границей сорбента. Закройте колонку сверху и снизу и сохраняйте колонку при комнатной температуре до следующего занятия.

1. Сразу же после окончания центрифугирования выньте пробирку из центрифуги. Осмотрите пробирку под ультрафиолетом. Бактериальный дебрис должен быть виден как осадок на дне пробирки. Надосадочная жидкость называется супернатантом. Обратите внимание на цвет осадка и супернатанта. Используя новую пипетку, перенесите 250 мкл супернатанта в чистую подписанную микроцентрифужную пробирку. Хорошо промойте пипетку.

1. Хорошо промытой пипеткой добавьте 250 мкл буфера для связывания в пробирку, содержащую супернатант. Поместите пробирку в холодильник до следующего занятия.

Вопросы к уроку 4

1. Какого цвета был осадок на этой стадии эксперимента? Какого цвета был супернатант? О чем это вам говорит?

1. Почему вы отбрасываете осадок на этой стадии?

1. Кратко опишите суть хроматографии белка и объясните ее назначение в этой работе.

Дата добавления: 2015-08-10