Гидрофобная хроматография

На протяжении уроков 4 и 5 растворимый GFP из супернатанта очищается с помощью гидрофобной хроматографии. GFP содержит несколько участков, состоящих из гидрофобных аминокислот, в результате чего общая гидрофобность белка оказывается очень высокой. Когда супернатант, содержащий большое количество GFP протекает через колонку в буферном растворе с высокой коцентрации соли (буфер для связывания) гидрофобные участки в составе GFP связываются с сорбентом. Другие, менее гидрофобные (или если хотите, более гидрофильные) белки протекают сквозь колонку, не задерживаясь. Эта простая процедура позволяет выделить зеленый флуоресцентный белок из сложной смеси бактериальных белков.

Нанесение содержащего GFP супернатанта на колонку

Когда ученики наносят содержащий GFP супернатант на колонку, важно проследить за тем, чтобы они не взмучивали поверхность сорбента, она должна быть сравнительно плоской. Небольшие неровности не окажут большого влияния на процесс; тем не менее, во время нанесения, промывки и элюции с колонки сорбент должен как можно меньше взмучиваться и смешиваться с буфером. Во время нанесения супернатанта на колонку, пипетка вносится в колонку и супернатант медленно выливается вдоль стенки. Когда супернатант полностью зашел в колонку, под УФ верхней части сорбента должно быть видно зеленое кольцо.

Во время процедуры хроматографии используются четыре разных буфера,и каждый из них должен медленно наноситься вдоль стенки, чтобы не повредить поверхность сорбента.

Буфер для уравновешивания

Буфер, содержащий среднее количество соли (2М (NH₄)₂SO₄ который используется чтобы «уравновесить» или «подготовить» колонку перед связыванием GFP.

Буфер для связывания

Равное количество буфера для связывания (4 М (NH₄)₂SO₄ добавляется к содержащему GFP бактериальному лизату, в результате чего GFP оказывается в растворе с такой же концентрацией соли, как и уравновешенная колонка (2 М). В растворе соли гидрофобные участки белка оказываются снаружи и могут взаимодействовать с гидрофобной поверхностью сорбента.

Буфер для промывки

Буфер со средней концентрацией соли (1.3 М (NH₄)₂SO₄ ), который используется для того, чтобы отмыть слабо связавшиеся белки от колонки. Зеленый флуоресцентный белок очень гидрофобный и остается связанным с колонкой. Добавлять промывочный буфер нужно очень аккуратно, чтобы минимизировать взмучивание сорбента.

Дата добавления: 2015-08-10