Токсические эффекты молекулярного кислорода и его производных

Как фактор внешней среды O₂ воздействует на современные прокариотные организмы двояко: с одной стороны, он может быть абсолютно необходимым, с другой — с молекулярным кислородом и его производными связаны токсические эффекты для клеток.

Молекулярный кислород. Существует ряд гипотез, объясняющих чувствительность прокариот к O₂. Согласно одной из них молекулярный кислород сам является токсическим соединением, агрессивное действие которого связано со способностью окислять клеточные метаболиты, необходимые для функционирования в восстановленном состоянии. Токсический эффект O₂ зависит от условий, при которых происходит взаимодействие с ним организмов: концентрации растворенного O₂, длительности экспозиции, состава окружающей среды.

Токсичность молекулярного кислорода, например, может быть следствием активного акцептирования им электронов с растворимых переносчиков, функционирующих в процессах брожения, что будет приводить к истощению внутриклеточного пула восстановленных доноров электронов, необходимых для биосинтезов. Действительно, было обнаружено, что активность растворимых флавопротеинов, способных функционировать как НАД(Ф)-H₂-оксидазы, повышалась в 5 — 6 раз при выращивании Clostridium acetobutylicum в аэробных условиях сравнительно с анаэробными. Сдвиг под влиянием O₂ электронных переносчиков в сторону их преимущественного нахождения в окисленном состоянии приводил к подавлению роста и изменению выхода продуктов брожения: прекращению синтеза масляной кислоты и накоплению более окисленного продукта — уксусной кислоты.

Наконец, для проявления токсического эффекта O₂ вполне достаточно окисления им какого-либо одного ключевого метаболита или фермента, приводящего к их инактивации. Известны три ферментные системы прокариот, особо чувствительные к молекулярному кислороду: нитрогеназа, гидрогеназа и рибулозодифосфаткарбоксилаза.

Нитрогеназная система, катализирующая фиксацию молекулярного азота, как известно, состоит из двух металлопротеинов: белка, содержащего железо и молибден, и белка, в состав которого входит только железо. Каждый белок необходим для проявления каталитической активности. Молекулярный кислород оказывает повреждающее действие на оба белка нитрогеназы, но более чувствителен к O₂ Fe-белок.

Чувствительность белков нитрогеназы к O₂ определяется прежде всего чувствительностью их металлоцентров, которые участвуют как в связывании субстрата, так и в переносе электронов. Поскольку при этом может происходить и ступенчатое восстановление O₂ по одноэлектронному механизму, в качестве продуктов такого восстановления возникают супероксидные ионы, перекись водорода и синглетный кислород, вносящие свой вклад в окислительное повреждение нитрогеназы.

Нитрогеназные белки являются не единственным компонентом азотфиксирующей системы, чувствительным к O₂. Ферредоксины и флаводоксины, донирующие электроны на нитрогеназу, могут автоокисляться и подвергаться необратимым окислительным повреждениям.

Гидрогеназы многих прокариот также обнаруживают высокую чувствительность к молекулярному кислороду, которая in vitro в большой мере зависит от метода выделения и степени очистки. Как правило, более устойчивы к O₂ неочищенные ферментные препараты. По сравнению с мембрансвязанным ферментом устойчивость к O₂ гидрогеназы, отделенной от мембраны, обычно ниже. Фермент, полученный из клеток анаэробов, более чувствителен к O₂, чем выделенный из клеток аэробных прокариот.

Каталитическая активность рибулозодифосфаткарбоксилазы, фермента, катализирующего фиксацию CO₂ у подавляющего большинства автотрофных прокариот, зависит ст парциальных давлений СO₂ и O₂. При высокой концентрации O₂ и низкой — CO₂ преобладает оксигеназная реакция:

Молекулы O₂ и СO₂ конкурируют за каталитический центр фермента. И хотя сам фермент не обнаруживает повышенной чувствительности к молекулярному кислороду и, следовательно, не повреждается при его высокой концентрации, увеличение O₂ в среде приводит к изменению функционирования рибулозодифосфаткарбоксилазы. Протекание ферментативной реакции по оксигеназному пути приводит к истощению клеточного пула молекул рибулозодифосфата и, как следствие этого, понижению активности восстановительного пентозофосфатного цикла в клетке.

Помимо существования в основной форме в биологических реакциях и под действием различных физико-химических факторов возникают продукты неполного восстановления O₂, более реакционно способные и обладающие высокой токсичностью для клетки. Как известно, для полного восстановления молекулярного кислорода, приводящего к образованию молекулы воды, требуются 4 электрона:

O₂ + 4H⁺ + 4 e ^–  2H₂O

У большинства прокариот имеются ферменты, катализирующие реакции одновременного переноса 4 электронов на O₂, при которых не обнаружено каких-либо промежуточных продуктов восстановления O₂. Это цитохромоксидазы и некоторые медьсодержащие ферменты. Возможно, что в этих реакциях и возникают короткоживущие продукты неполного восстановления O₂, но они остаются связанными с ферментами, не выходят в цитоплазму и практически не наносят вреда клетке.

Супероксидный анион. Если восстановление молекулярного кислорода происходит ступенчато, то при переносе 1 электрона на O₂ образуется надпероксидный (супероксидный) анион:

O₂ + e ^–  O₂^–.

Последний содержит неспаренный электрон, поэтому является отрицательно заряженным радикалом (анион-радикалом). Он может протонироваться с образованием нейтрального гидропероксидного радикала:

O₂^–. + H⁺  HO₂^.

В последнее время признание получила точка зрения, согласно которой основную опасность для организмов представляют продукты, образующиеся при одноэлектронном восстановлении молекулы O₂, одним из которых является супероксидный анион.

Можно назвать много биохимических реакций, приводящих к его возникновению. Супероксидные анионы генерируются при взаимодействии с молекулами O₂ различных компонентов (восстановленные флавины, хиноны, тиолы, FeS-белки), а также в реакциях, катализируемых рядом флавопротеиновых ферментов. Наконец, в процессе фотосинтеза имеет место поток электронов. Большинство реакций фотосинтеза — это реакции одноэлектронного переноса. Поэтому в системе часто возникают супероксидные анионы. Помимо реакций биологической природы O₂^–. могут возникать вне клетки в водных растворах при воздействии на них ультразвуком, в результате фотохимических, химических и электрохимических процессов.

Опасность любых реакционно активных соединений в значительной степени зависит от их стабильности. В этом плане ионы O₂^–. весьма опасны, так как время их "жизни" в водной среде продолжительнее, чем у остальных O₂-производных радикалов. Поэтому экзогенно возникшие O₂^–. могут проникать в клетку и (наряду с эндогенными) участвовать в реакциях, приводящих к различным повреждениям: перекисном окислении ненасыщенных жирных кислот, окислении SH-групп белков, повреждении ДНК и др. Токсичность супероксидных анионов может увеличиваться за счет вторичных реакций, ведущих к образованию гидроксидных радикалов (OH^.) и синглетного кислорода (*O₂).

Многие прокариоты, относящиеся к разным физиологическим группам, в том числе и строго анаэробные виды, имеют специфическую защиту в виде фермента супероксиддисмутазы, осуществляющего перехват ионов O₂^–. и катализирующего их дисмутацию. Образующиеся супероксидные анионы дисмутируют в реакции, протекающей спонтанно (3) или катализируемой супероксиддисмутазой (4):

O₂^–. + O₂^–. + 2H⁺  H₂O₂ + *O₂; (3)

O₂^–. + O₂^–. + 2H⁺  H₂O₂ + O₂. (4)

Различия между обеими реакциями в их скоростях (скорость ферментативной реакции приблизительно на четыре порядка выше, чем спонтанной), а также в том, что при спонтанной реакции дисмутации одним из первоначально возникающих продуктов является синглетный кислород, в то время как при ферментативной реакции образующийся кислород находится в основном триплетном состоянии.

Гидроксидный радикал. Супероксиданион может взаимодействовать с H₂O₂ с образованием гидроксидного радикала (OH^.), превосходящего O₂^–. по окислительной активности и токсичности:

O₂^–. + H₂O₂ + H⁺  O₂ + H₂O + OH^.. (5)

Источником возникновения ОН^. могут служить реакции одноэлектронного окисления перекиси водорода, катализируемые железосодержащими соединениями, всегда имеющимися в клетках:

H₂O₂ + Fe²⁺  Fe³⁺ + OH^– + OH^.. (6)

Помимо указанных выше реакций гидроксидные радикалы образуются также при радиолизе воды и в низких концентрациях обычно присутствуют в водных растворах. OH^. из всех известных окислителей является самым сильным, вызывающим радиационные повреждения многих типов биополимеров.

Перекись водорода. Перенос 2 электронов на O₂ приводит к образованию перекисного аниона (7) или перекиси водорода (8):

O₂ + 2 e ^–  O₂^2–; (7)

O₂ + 2H⁺ + 2 e ^–  H₂O₂. (8)

Катализировать перенос 2 электронов на O₂ могут содержащиеся в клетках прокариот оксидазы флавиновой природы и некоторые цитохромы. Источником H₂O₂ могут быть реакции автоокисления некоторых негемовых FeS-белков, а также описанные выше реакции дисмутации супероксидных радикалов (реакции 3 и 4). Перекись водорода образуется у всех аэробов и факультативных анаэробов, растущих в аэробных условиях, так что ее возникновение в клетках прокариот — естественный процесс.

Перекись водорода — наиболее стабильный из промежуточных продуктов восстановления O₂, но и наименее реакционноспособный. У большинства аэробных прокариот H₂O₂ быстро разлагается с помощью гемсодержащих ферментов каталазы и пероксидазы. В отсутствие их H₂O₂ может накапливаться в летальных для организма концентрациях.

H₂O₂ вызывает окисление SH-групп в белках, перекисное окисление ненасыщенных жирных кислот. Однако эти реакции протекают с измеримыми скоростями, если концентрация H₂O₂ в клетке будет на четыре порядка выше той, которая обычно достигается in vivo. Поэтому не исключено, что перекись водорода опасна не из-за прямого взаимодействия с компонентами клетки, а потому, что, реагируя с O₂^–. (реакция 5) или ионами Fe²⁺ (реакция 6), может приводить к образованию гидроксидного радикала.

В 20-х гг. большой популярностью пользовалась теория, объясняющая токсичность O₂ накоплением в клетке перекиси водорода. Однако позднее были обнаружены более токсичные для клетки формы O₂ среди первичных и вторичных продуктов его одноэлектронного восстановления (O₂, OH^., *O₂).

Синглетный кислород. В норме O₂ находится в стабильном состоянии, называемом триплетным и характеризующемся наименьшим уровнем молекулярной энергии. В определенных условиях молекула O₂ переходит в одно из двух возбужденных синглетных состояний (*O₂), различающихся степенью энергизованности и длительностью "жизни". У большинства живых клеток в темноте основным источником синглетного кислорода служит спонтанная дисмутация супероксидных анионов (см. реакцию 3). Синглетный кислород может возникать также при взаимодействии двух радикалов:

O₂^–. + OH^.  OH^– + *O₂. (9)

Вероятно, любая биологическая система, в которой образуется O₂, может быть активным источником синглетного кислорода. Однако последний возникает и в темновых ферментативных реакциях в отсутствие O₂.

Давно было известно, что на свету токсичность молекулярного кислорода для живых организмов повышается. Этому способствуют находящиеся в клетке вещества, поглощающие видимый свет, — фотосенсибилизаторы ⁶³ Многие природные пигменты могут быть фотосенсибилизаторами. В клетках фотосинтезирующих организмов активными фотосенсибилизаторами являются хлорофиллы и фикобилипротеины. Окисление биологически важных молекул под влиянием видимого света в присутствии молекулярного кислорода и фотосенсибилизатора получило название фотодинамического эффекта.

⁶³ Фотосенсибилизаторы — молекулы, способные поглощать свет и индуцировать химические реакции, которые в их отсутствие не происходят. Способность поглощать свет обусловлена наличием в молекулах хромофорных группировок, содержащих обычно циклические ядра. Известно более 400 веществ, обладающих свойствами фотосенсибилизаторов. Среди природных веществ фотосенсибилизаторами являются хлорофиллы, фикобилины, порфирины и промежуточные продукты их синтеза, ряд антибиотиков, хинин, рибофлавин и др. Некоторые фотосенсибилизаторы действуют только в присутствии O₂, вызывая фотодинамический эффект.

Поглощение видимого света приводит к переходу молекулы фотосенсибилизатора в возбужденное синглетное состояние (*Д):

Д+h  *Д

Молекулы, перешедшие в синглетное состояние, могут возвращаться в основное (Д) или переходить в долгоживущее триплетное состояние (*Д), в котором они фотодинамически активны. Установлено несколько механизмов, с помощью которых возбужденная молекула (*Д) может вызывать окисление молекулы субстрата. Один из них связан с образованием синглетного кислорода. Молекула фотосенсибилизатора в триплетном состоянии реагирует с O₂ и переводит его в возбужденное синглетное состояние:

^TД + O₂  Д + *O_2.

Синглетный кислород окисляет молекулу субстрата (В):

B +*O₂  ВO₂.

Фотодинамический эффект обнаружен у всех живых организмов. У прокариот в результате фотодинамического действия индуцируются повреждения многих типов: утрата способности формировать колонии, повреждение ДНК, белков, клеточной мембраны. Причина повреждений — фотоокисление некоторых аминокислот (метионина, гистидина, триптофана и др.), нуклеозидов, липидов, полисахаридов и других клеточных компонентов.

Клетки содержат вещества, выполняющие функцию тушения синглетного кислорода и понижающие возможность структурных и иных повреждений, вызываемых им. Одним из "тушителей" синглетного кислорода служат каротиноиды, защищающие фотосинтезирующие организмы от летальных эффектов, фотосенсибилизируемых хлорофиллом. Перехватчиками *O₂ являются также различные биологически активные соединения: липиды, аминокислоты, нуклеотиды, токоферолы и др.

Озон и атомарный кислород. Продуктами молекулярного кислорода являются также атомарный кислород (O) и озон (O₃). Известно, что молекулярный кислород сильно поглощает свет в дальней УФ-области (160–240 нм). Поглощенный фотон вызывает диссоциацию молекулы кислорода на два атома:

O₂ +h  2O.

Затем спонтанно протекает реакция, приводящая к образованию молекулы озона:

O₂ + O  O₃

Озон может возникать из молекулярного кислорода в воздухе при сильных электрических разрядах, а также при электролизе воды и в некоторых реакциях, где он сопровождает образование O₂. В некоторых реакциях окисления с помощью озона образуется синглетный кислород. Как окислители озон и атомарный кислород сильнее O₂. Озон может реагировать практически со всеми типами соединений с образованием радикалов.

Дата добавления: 2015-08-03