Аномалии клеточных систем in vitro

Нередко забываются значительные, кардинальные отличия в особенностях длительно поддерживаемых лабораторных культур по сравнению с нормальными клетками. Действительно, хотя последние и можно сколько-то времени культивировать in vitro без специальных цитологических и цитогенетических манипуляций, однако это все же не то. В подобных первичных культурах клетки поделятся несколько раз, затем — погибнут (ограниченное время жизни; репликативное старение; апоптоз). Но ведь именно на длительно культивируемых клетках, когда известно, что эта либо та линия или клон с тем-то и тем-то произошли от тех-то или тех-то конкретных клеток-прародителей, и можно безошибочно связать полученные отсроченные эффекты с исходными воздействиями. Так что корректное выявления РИНГ требует длительно поддерживаемых культур. Однако почти все такие лабораторные культуры (за исключением фибробластов и некоторых других менее известных клеток [РК42]) нормальными клетками, либо клетками в нормальных физиологических состояниях, не являются. В связи с необходимостью отмены блока деления, эти культуры получают либо просто из раковых клеток, где все аномальные особенности уже имеются «по природе» (как, например, в HeLa, первоначально полученных из рака шейки матки человека [РП4, РЯ5]), либо осуществляют над нормальными клетками определенные манипуляции. Необходима по крайней мере их иммортализация — способность к образованию клеточной линии с длительным неограниченном размножением (рост в культуре в виде монослоя) [РА1]. (Не всегда иммортализация приводит к злокачественной трансформации.) Бывают лабораторные культуры и трансформированных клеток, например, трансформированных онкогенными вирусами. Подобные культуры могут расти уже в виде трехмерных образований (в организме — в виде опухолей) [РА1]. Как было видно из табл. 2.6.1, великое множество объектов, на которых выявлена РИНГ in vitro, действительно представляют собой именно иммортализованные, трансформированные либо просто раковые клетки.

Но в табл. 2.6.1 есть и как бы нормальные клетки — лимфоциты человека, гемопоэтические клетки и пр. Долгоживущие, длительные (long-term) культуры этих клеток поддерживаются in vitro десятки дней, но, понятно, в специальных условиях: при наличии ростовых факторов (например, в фетальной сыворотке), митогенов, колониестимулирующих соединений.

Может показаться, исходя из обыденно-научных представлений, что это культуры вполне нормальных клеток, но дело обстоит не совсем так. Поскольку подобные исходно нормальные клетки смогли адаптироваться к длительному существованию вне организма, то они уже не являются полностью нормальными. К тому же зрелые лимфоциты в организме не делятся, они находятся в фазе G₀. В длительных же культурах лимфоциты после стимуляции претерпевают множество «незапланированных» делений. Исходя из общих соображений, могут не поверить относительно аномальности почти всех клеток в длительных культурах, этот вопрос слишком стар и близок к философским обоснованиям корректности исследований исключительно in vivo, имевшим место на заре изучения очищенных белков и ферментов. Данные соображения ныне почти забыты в спешке многих десятилетий опытов in vitro. Сошлемся, однако, на том англоязычной монографии-сборника «Апоптоз и контроль клеточного цикла при раке» (1996) [AA8]. Первая же статья, которая устрашающе называется «Введение в жизнь и смерть» [AS31], начинается с рассмотрения именно указанного вопроса.

Отмечается, что число клеток в теле человека поддерживается путем баланса между пролиферацией и апоптозом (программированной клеточной гибелью). Оба этих процесса регулируются митогенами, ростовыми факторами и пр. И что обычно исследователи изучают деление клеток на лабораторных культурах. А вот с культурами-то дела в плане цитогенетической нормальности, так сказать, и не совсем в порядке (выделено мною — А.К.):

«Большинство лабораторных культур трансформировано вирусами, к примеру, вирусом Эпштейна-Барр, который отменяет природные регуляторные механизмы, что и позволяет клеткам неограниченно долго расти in vitro. Однако, даже если для культур не выполнено умышленное инфицирование вирусом, эти клетки все равно аномальны, поскольку они адаптировались к росту в культуре. Линии клеток in vitro часто имеют повышенную частоту аберраций хромосом или мутаций, делеции или амплификации специфических генов. Нередко эти гены регулируют ключевые точки клеточного цикла, поэтому мутации (либо делеции) в них приводят к пролиферативной аномальности клеток и т.д.» [AS31].

Следует помнить также, что, помимо прочего, стимуляция митогенами может играть роль в ранней фазе неопластической трансформации [AB10].

Наконец, как было подробно рассмотрено выше в подразделе 2.3.3, при каждом делении нормальных клеток млекопитающих укорачивается длина концевых теломерных повторов, а короткие теломеры, согласно ряду данных — это предпосылка для нестабильности генома, в том числе и связанной со старением клеток. И только в иммортализованных, трансформированных и раковых клетках, вследствие «включения» фермента теломеразы, длина теломер поддерживается, что и обеспечивает таким клеточным линиям бессмертие (см. выше 2.3.3 и рис. 2.3.3). Поэтому для долгоживущих in vitro культур лимфоцитов и гемопоэтических клеток (не стволовых) одно из двух: либо их потомки имеют весьма укороченные теломеры, что, конечно, сказывается на стабильности их генома (который как раз у потомков и изучают), либо такие культуры приобретают активность теломеразы, что, вновь, выводит их из категории нормальных клеток (см. выше рис. 2.3.3).

Так что при выявлении «истинной» РИНГ возникают определенные трудности, которые кажутся малопреодолимыми. Действительно, понятно, что корректная регистрация данного феномена требует поддержания долгоживущих культур для исследования отдаленных потомков первоначально облученной клеточной популяции. А такие долгоживущие культуры, что из клеток рака, что из иммортализованных и трансформированных клеток, исходно нестабильны в той или иной степени. Более того, даже нетрансформированные и неиммортализованные длительные культуры, к примеру, лимфоцитов и гемопоэтических клеток, опять же, как мы видим, все равно аномальны по той или иной причине, раз они стали способными долго культивироваться вне организма.

Правда, остаются еще фибробласты, которые могут делиться и поддерживаться in vitro в диплоидном виде и без каких-либо аномалий и трансформаций (во всяком случае, так принято считать [РК42]). Но и для фибробластов, как следует из предыдущего подраздела 2.6.2, с РИНГ далеко не все столь просто. Для некоторых линий данных клеток, по видимости без аномалий, предполагаются такие генетические особенности, которые выводят эти клетки из категории нормальных.

Не следует думать, что мы полностью отрицаем информативность и практическую значимость опытов in vitro вообще, в том числе на модельных линиях клеток, от раковых до лимфоцитов. Ранее и нами проводились длительные биохимические и радиобиологические эксперименты на перевиваемой опухоли мышей, пассируемой как in vivo, так и in vitro [РК26, РК27]. Нет сомнений, что выявленные тогда качественные закономерности функционирования в клетках данной опухоли определенного фактора репликации и репарации ДНК [РК24, РК30, AK28] являются общими для всех эукариот [РК10, РК11]. Но мы, изучая модельную специфическую линию клеток, никогда не претендовали на распространение обнаруженных для нее феноменов на дозовые, количественные закономерности для всех клеток и тканей высших организмов.

Помнится, что и тогда, в давнем 1993 г., мы столкнулись с проблемой нестабильности генома. Послав в биохимический журнал обзор об участии исследованного нами белка в репликации и репарации ДНК у эукариот, где рассматривались данные опытов на клетках той самой перевиваемой опухоли мышей (асцитной карциномы Эрлиха), мы получили рецензию с замечаниями. Одним из замечаний было то, что закономерности, полученные нами для конкретных раковых клеток, мы слишком смело распространяем для всех клеток эукариот, в то время как для клеток рака характерна повышенная нестабильность генома и увеличенный уровень цитогенетических повреждений по сравнению с нормой. Данный момент тогда, в начале 1990-х гг., не приходил в голову. Но, проанализировав соответствующие источники и изучив вопрос, я еще в то время обнаружил, что нормальных клеток-то для опытов in vitro — почти что и нет. Для биохимии нормальных клеток надо изучать ткани или первичные культуры, которые вскоре и погибнут. Но если получать данные по клеточным циклам, что-то «длительное», то сразу можно ждать наличия дефектного объекта — иммортализованных (в той или иной степени), трансформированных и пр. клеток.

Я тогда, в 1993 г., именно это и ответил рецензенту, причем привел ряд примеров, аналогичных нашему исследованию, когда в классических работах по биохимии и молекулярной биологии клеточные культуры-объекты in vitro были в той или иной степени дефектны, включая нестабильность генома. Эти мои аргументы, что, дескать, «все кругом виноваты», оказались для рецензента обзора убедительными, и все сошло очень хорошо [РК11].

Подводя итог настоящему подразделу, можно сделать три заключения:

· Наиболее корректные и однозначно интерпретируемые экспериментальные данные, доказывающие реальность РИНГ, можно получить только в опытах in vitro.

· Но практически все культуры in vitro представлены клетками, которые по природе своей должны быть аномально чувствительны применительно к индукции РИНГ.

· Поэтому если стоять на строгих научных позициях, то опыты по регистрации РИНГ in vitro (независимо от доз) не могут служить доказательством реальности этого феномена in vivo, для людей и животных.

К тому же, как мы видели выше в табл. 2.6.1, никакой индукции РИНГ in vitro малыми дозами радиации для порядка сорока линий и типов клеток, более или менее нормальных, до сих пор не обнаружено. Данные свидетельствуют, что эффект характеризуется порогом при порядка 0,5 Гр.

Действие радиации на клетки in vivo, как правило, в значительной степени слабее, чем in vitro [РЯ5][108]; напомним к тому же (см. выше рис. 2.1.1) про звенья защиты/репарации/элиминации от повреждений ДНК: в организме по сравнению с клетками имеется еще система иммунного надзора. Поэтому, исходя из данных в табл. 2.6.1, даже априори ясно, что в условиях организма животных и человека РИНГ не должна индуцироваться малыми дозами радиации в принципе. А выше приводилось мнение американских исследователей Л. Дугана и Дж. Бедфорда, согласно которым для нормальных клеток никакой РИНГ в природе не имеется вообще [AD28] (см. подраздел 2.6.1). Мы не столь маргинальны, как эти американские авторы, и делаем свой следующий предварительный вывод: «Для нормальных клеток никакой РИНГ при малых дозах редкоионизирующей радиации в природе иметься не должно».

Ранее мы утверждали, что главные, основополагающие свидетельства в естественнонаучных дисциплинах получают не путем логики и не из своей головы, а путем прямых экспериментов. (Эти эксперименты как раз и собраны в табл. 2.6.1.)

Осознание данного факта является кардинальным отличием биологического мышления от мышления математического и физико-математического, когда весьма многое выводят как бы «из головы». Вот почему никогда не придут к консенсусу математики, сторонники ЛБК и расчетчики рисков убоя человека током от батарейки из часов, с биологами и медиками, специалистами в области радиобиологии и радиационной медицины, которые действительно задумались над проблемой малых доз и владеют необходимой информацией. Математики и физики утверждают, что в области малых доз для выявления статистически значимых эффектов (раков и генетических патологий) необходимы выборки в сотни тысяч, если не в миллионы единиц (см. например, документы [AB10, AU13, AU14, AU16]). И что, поэтому, никто не способен опровергнуть их положение о вреде малых доз, о вреде тока от батарейки из часов. Данное мнение — типичный пример схематического математического мышления, которое прилагается к столь сложно интерпретируемым в рамках точных наук системам, какими являются клетка, организм и популяция. В «одних координатах» такие системы не описываются; к тому же не учитывается возможность смены знака эффекта.

Если мнение математиков о «миллионных» выборках верно, то, следовательно, аналогичная картина должна была бы наблюдаться и в случае реализации эффектов облучения не как повреждающих, а как гормезисных. Для выявления гормезиса мы вновь должны были бы оперировать миллионными выборками, ничего реального, следовательно, не имея. Странно; но почему-то для целого ряда популяций человека в области малых доз гормезис (хотя такие эффекты невелики по величине) был продемонстрирован, в том числе и по ракам. И это — без всяких «миллионных» групп. Темой нашей монографии, вернее, ее первой книги, не является гормезис, но нам известны соответствующие публикации, где эффекты были описаны для ряда популяций и профессиональных групп по всему миру. Приводим некоторые ссылки [РБ8, РК39, AC1, AF5, AH11, AL33, AL34, AP16, AS46].

Дата добавления: 2015-07-20