Ход работы. На установленном горизонтально столике для заливки размещают стекла и заливают

На установленном горизонтально столике для заливки размещают стекла и заливают горячий раствор 1% агарозы, 3 мл на стекло. Толщина геля при этом получается 1-2 мм.

В застывшем геле с помощью пробойника формируют лунки (1 лунка в центре, 6 – по кругу).

Стекла помещают на фильтровальную бумагу в чашки Петри.

Объем вносимых проб - 20 мкл.

ц – центральная лунка

1 – 6 лунки

I. Титрование сывороток

I.1) Титрование сывороток к лактоферину (Лф): в центральную лунку вносят Лф (0,5 мг/мл), в лунку 1 вносят сыворотку к Лф №1 или сыворотку к Лф №3, в остальные – сыворотку в различных разведениях (последовательные разведения в 2 раза: в лунку 2 сыворотку к Лф, разведенную в 2 раза буфером для разведения проб, в лунку 3 – в 4 раза и т.д.). Стекла I-1 и I-3.

I.2) Титрование сывороток к миелопероксидазе (МПО): в центральную лунку вносят МПО (0,5 мг/мл), в лунку 1 вносят сыворотку к МПО №2 или сыворотку к МПО №4, в остальные – сыворотку в различных разведениях (последовательные разведения в 2 раза: в лунку 2 сыворотку к МПО, разведенную в 2 раза буфером для разведения проб, в лунку 3 – в 4 раза и т.д.). Стекла I-2, I-4, I-2-ДАБ и I-4-ДАБ, 2 стекла для окраски гелей кумасси, 2 – для выявления пероксидазной активности МПО с помощью диаминобензидина (ДАБ).

II. Тестирование образцов на наличие антигена (данные образцы и сыворотки вносятся в исходной концентрации).

II.1А) В центральную лунку вносится сыворотка к Лф №1 или сыворотка к Лф №3, в лунку 1 – экстракт белков лейкоцитов №1, в лунку 2 – сыворотка молока человека, в лунку 3 - сыворотка молока коровы, в лунку 4 - сыворотка молока козы, в лунку 5 – слезы №1, в лунку 6 – слюна. Стекла II-1А и II-3А.

II.1В) В центральную лунку вносится сыворотка к Лф №1 или сыворотка к Лф №3, в лунку 1 – экстракт белков лейкоцитов №1, в лунку 2 – экстракт белков лейкоцитов №2, в лунку 3 – экстракт белков лейкоцитов №3, в лунку 4 – слезы №1, в лунку 5 – слезы №2, в лунку 6 – слюна. Стекла II-1В и II-1В.

II.2) В центральную лунку вносится сыворотка к МПО №2 или сыворотка к МПО №4, в лунку 1 – экстракт белков лейкоцитов №1, в лунку 2 – экстракт белков лейкоцитов №2, в лунку 3 – экстракт белков лейкоцитов №3, в лунку 4 – слезы №1, в лунку 5 – слюна, в лунку 6 – сыворотка молока человека. Стекла II-2, II-4, II-2-ДАБ и II-4-ДАБ, 2 стекла для окраски гелей кумасси, 2 – для выявления пероксидазной активности МПО с помощью ДАБ.

III. В центральную лунку вносится экстракт белков лейкоцитов №1, в лунки 1 и 6 - сыворотка к Лф №1, в лунки 2 и 5 - сыворотка к МПО №2, в лунку 3 - сыворотка к Лф №3, в лунку 4 - сыворотка к МПО №4. Стекла III и III-ДАБ, одно стекло для окраски геля кумасси, второе – для выявления пероксидазной активности МПО с помощью ДАБ.

Иммунодиффузия идет в течение ночи при комнатной температуре во влажной камере (необходимо смочить водой фильтровальную бумагу в чашке Петри, и таким образом, получаем влажную камеру). Стекла и чашки Петри необходимо подписать, чтобы впоследствии не перепутать.

Вынимаем фильтровальную бумагу из чашек Петри.

Дата добавления: 2015-07-20