Студопедия
Случайная страница | ТОМ-1 | ТОМ-2 | ТОМ-3
АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатика
ИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханика
ОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторика
СоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансы
ХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника

Якісне і кількісне визначення білка

Читайте также:
  1. II. ТЕРМІНИ ТА ВИЗНАЧЕННЯ ПОНЯТЬ
  2. Валові доходи та особливості їх визначення.
  3. Вдосконалення трудового законодавства в частині визначення сфери укладення контракту
  4. Визначення величин розмірних ознак та прибавок, необхідних для побудови базового креслення конструкції виробу
  5. Визначення витрат води для пожежогасіння
  6. Визначення витрат, які формують виробничу собівартість продукції (робіт, послуг) звітного періоду
  7. Визначення втрат напору в мережі до пожежі

Наявність білків у харчових продуктах визначається якісними реакціями, які умовно можна розділити на дві групи: кольорові реакції і реакції осадження.

Серед першої групи розрізняють універсальні реакції:

- біуретова - на пептидні зв'язки;

- нінгідринова - на α-амінокислоти

та специфічні, які виявляють присутність у білках певних залишків амінокислот:

- ксантопротеїнова реакція на залишки ароматичних амінокислот;

- реакція Паулі на гістидин і тирозин;

- реакція Адамкевича і Вуазене на триптофан;

- реакція Сакагучі на аргінін;

- нітропрусцидна реакція на цистеїн.

У другій групі реакцій білки осаджують дією солей, органічних розчинників, концентрованих кислот, лугів, йонами важких металів, високими температурами, створенням рН ізоелектричної точки, порушуючи гідратну оболонку білків.

Білкові речовини харчової сировини, включаючи ферменти, часто визначають якість продуктів і для вивчення необхідно виділяти їх по можливості в нативному (не денатурованому) стані. Денатуруючу дію різних факторів на білки можна пом'якшити, якщо проводити їх виділення при температурі не більше 4ºС.

Загальна схема виділення білків включає: подрібнення біоматеріалу (гомогенізація); екстрагування білків; очищення і одержання індивідуального білка. Руйнування клітинної структури здійснюється подрібненням сировини у гомогенізаторах, мельницях, чергуванням заморожування і танення, застосуванням ультразвуку, високочастотних коливань, високого тиску (прес-методів), методу «азотної бомби». Метод обирають залежно від виду матеріалу, який аналізують. Важче гомогенізувати рослинні і мікробні клітини із-за наявності клітинної стінки. Для цього застосовують розтирання з твердими, абразивними матеріалами (пісок, скло) або обробку ферментними препаратами (целюлоза, хініназа, ліпаза, лізоцим).

Умови екстрагування білків (час, температура) підбираються емпірично.

Більшість тваринних білків добре розчинні у 5-10% розчинах солей, тоді як для переведення в розчин білків зернових застосовують органічні розчинники, буферні системи, неіонні детергенти, які розривають білок-ліпідні або білок-білкові зв'язки.

Розчинники підбирають із врахуванням розриву в білках певних зв'зків. Так, оцтова кислота послаблює іонні зв’язки, сечовина – водневі і гідрофобні, саліцилати натрію і додецилсульфат натрію – гідрофобні й іонні, розчини спиртів – водневі і гідрофобні, органічні розчинники – білок-ліпідні.

СН3 – (СН2)10 – СН2 – О – SO3Na – додецилсульфат натрію (ДДС-Nа).

Фракціонування і очищення білків базуються на різних розмірах молекул, розчинності, заряді і спорідненості до специфічних хімічних груп.

Осадження білків з розчинів солями лужних і лужноземельних металів називається висолюванням. Для висолювання білків часто застосовують сульфат амонію, при цьому краще зберігається розчинність і ферментативна активність білків. Глобуліни випадають в осад переважно при 50% концентрації солі, альбуміни – при 100%, при інших концентраціях (20%-100%) випадають в осад інші білки (проламіни, глютеліни).

Для виділення і очищення білків використовуються різні види хроматографії: адсорбційна, розподільна, іонообмінна і хроматографія по спорідненості.

Гель-фільтрація (метод молекулярних сит) полягає у пропусканні білків через колонку з гелем сефадексу, декстрану, полістиролу, агарози, або пористих скляних кульок. У результаті білки розподіляються по колонці за молекулярною масою і можуть бути зібрані окремими фракціями.

Принцип методів електрофоретичного розділення полягає у здатності молекул пептидів, які мають заряд, рухатись в електричному полі з певною швидкістю, яка залежить від напруги електричного поля, заряду білків і сили тертя. Більш поширеними у наш час є методи зонального електрофорезу, в яких використовується крохмальний, або поліакриламідний (ПААГ) гель. Серед них широко застосовують диск-електрофорез у ПААГ, двовимірний електрофорез у ПААГ (суміш розділяють спочатку в горизонтальному напрямі у стовпчиках гелю, а потім у вертикальному на гелієвих пластинах).

Методом ультрацентрифугування білки розподіляються на різних рівнях центрифужної пробірки окремими зонами.

Очищення білків від низькомолекулярних сполук (солей, цукрів, амінокислот) здійснюється методом діалізу, гель-фільтрації, кристалізації, ультрафільтрації. При діалізі застосовують напівпроникні мембрани (целофан, колоїдна плівка), через які білки не проникають, а залишаються у мішечку на відміну від низькомолекулярних сполук.

У методі ультрафільтрації, який застосовується, наприклад, у виробництві білків з молочної сироватки, соєвих білкових ізолятів створюється різниця тиску на мембрані за рахунок продавлювання білкового розчину. Для мембран використовується целюлоза, поліелектролітні комплекси.

Гомогенність білка на останньому етапі визначається мінімум двома методами, які оцінюють його фізико-хімічні властивості. Найбільш достовірними є ультрацентрифугування в градієнті густини, диск-електрофорез у ПААГ, імунохімічні методи.

Вміст білка у харчових продуктах зазвичай визначають за кількістю азоту з використанням методу Кьєльдаля. Він (з 1983р.) неодноразово модифікувався із застосуванням різних каталізаторів і умов мінералізації. На основі цього методу створені автоматичні аналізатори «Кьєльфос». Метод Кьєльдаля має певні недоліки, але залишається уніфікованим і включений до ГОСТів. Його суть полягає у мінералізації подукта і, визначення у ньому вмісту азоту. Для переведення кількості азоту у вміст білка використовується коефіцієнт 6,25. Прийнятий він тому, що більшість білків містить 16% азоту (100/6,25 = 16). Але більш вірним є використання коефіцієнтів, що відповідають фактичному вмісту білка: для пшениці, жита, ячменю, вівса, соняшника – 5,7; для сої – 5,8; для кукурудзи і м’яса – 6,25; для молока – 6,38.

Є й інші, достатньо дорогі, методи, такі як: метод Дюма, нейтронно-активаційний з фенолятгіпохлоридом, на приладі «Технікон».

Принцип методу Дюма полягає в розкладанні органічної сполуки в атмосфері вуглекислого газу до газоподібного стану з подальшим вимірюванням об’єму азоту.

Широке розповсюдження одержав метод інфрачервоної спектроскопії, в основі якого лежить поглинання білками світла з певною довжиною хвилі і вимірювання інтенсивності його відбивання у приладах-аналізаторах.

Відомі методи кількісного визначення білка за ступенем помутніння (нефелометричний), здатності білків адсорбувати барвники (кумасі синій R-250, амідочервоний) і заломлювати промені світла.

Найбільш зручними є методи з кумасі синім, біуретовий і Лоурі. В основі методу Лоурі лежить відновлення фосфомолібденової кислоти тирозином і триптофаном з одночасним протіканням біуретової реакції. За оптичною густиною з використанням калібрувальних графіків знаходять концентрацію білка у розчинах.


Дата добавления: 2015-12-07; просмотров: 162 | Нарушение авторских прав



mybiblioteka.su - 2015-2024 год. (0.008 сек.)