Завдання 2. Дослідження функціонування ЦТК мітохондрій за швидкістю використання ацетил-S-КоА та інгібуючий вплив малонової кислоти на цей процес.

Принцип методу. Перетворення ацетил-S-КоА в присутності мітохондрій, що містять ферменти ЦТК, супроводжується виділенням СО₂. В якості джерела ацетил-S-КоА, що вступає в ЦТК, використовують піровиноградну кислоту (ПВК). ПВК під дією мультиферментного піруват-дегідрогеназного комплексу мітохондрій піддається окисному декарбоксилуванню з утворенням ацетил-S-КоА.

Якщо блокувати ЦТК малонатом (малоновою кислотою), то ацетил-S-КоА не використовується і НS-КоА не вивільняється. Малонат є класичним конкурентним інгібітором сукцинатдегідрогенази – ферменту ЦТК, оскільки зв’язується з її активним центром та перешкоджає зв’язуванню субстрату – сукцинату (янтарної кислоти).

Хід роботи. Дві пробірки – контрольну та дослідну заповнюють реактивами за таблицею:

Вміст пробірок	Контроль	Дослід
Фосфатний буфер, рН = 7,4, мл	2,0	2,0
Розчин піровиноградної кислоти, мл	1,0	1,0
Малонова кислота, мл	1,0	-
Фізіологічний розчин, мл	-	1,0
Суспензія мітохондрій, мл	1,0	1,0
Результати: виділення бульбашок СО2
Інкубація в термостаті: 15 хв при температурі 37^◦С
Реактив Фоліна-Мазензі	1,0	1,0
Результати: через 15 хвилин порівняти інтенсивність забарвлення

Через 15 хвилин після додавання реактиву Фоліна-Мазензі порівнюють інтенсивність забарвлення розчину в контрольній і дослідній пробірках.

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

Завдання 3. Дослідження функціонування ЦТК мітохондрій за швидкістю утворення атомів водню та вплив малонової кислоти на цей процес.

Принцип методу. При окисненні ацетил-S-КоА в ЦТК вивільняється водень, який відновлює метиленову синьку та перетворює її в безбарвну лейкосполуку. Час, протягом якого відбувається знебарвлення розчину, є показником інтенсивності протікання ЦТК в мітохондріях.

При блокуванні ЦТК малонатом (малоновою кислотою), вивільнення водню не відбувається і метиленова синька не знебарвлюється.

Хід роботи. Три пробірки – контрольну, дослідну № 1 та дослідну № 2 заповнюють реактивами за таблицею:

Вміст пробірок	Пробірки
Контроль	Дослід №1	Дослід №2
Фосфатний буфер, рН = 7,4, мл	2,0	2,0	2,0
Розчин пірувату натрію, мл	0,5	0,5	0,5
Малонова кислота, мл	–	–	0,5
Фізіологічний розчин, мл	0,5	0,5	–
Суспензія мітохондрій, мл	–	0,5	0,5
Суспензія мітохондрій після кип’ятіння	0,5	–	–
Розчин метиленової синьки, мл	0,5	0,5	0,5
Інкубація в термостаті при температурі 37^оС
Результати: час, протягом якого відбувається знебарвлення розчину

Після додавання метиленової синьки всі пробірки поміщають у термостат при 37^оС і вимірюють час, на протязі якого відбувається втрата забарвлення розчину в кожній пробірці.

Зробити висновки.

Література

Основна:

1. Біохімічний склад рідин організму та їх клініко-діагностичне значення. Довідник / За ред. Склярова О.Я. – Київ: Здоров’я, 2003. – 192 c.

2. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – 508 с.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744 с.

4. Практикум з біологічної хімії / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – 298 с.

5. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Львів: Світ, 2006. – 271 с.

Додаткова:

1.Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф, Биологическая химия. – Москва: Медицина, 1998. – 701 с

2.Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – Москва: Мир, 2000. – 470 с.

3.Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. т. 1. – М.: Мир, 2004. – 381 с.

Дата добавления: 2015-10-29