Дослід 1. Провести порівняльний аналіз активності холінестерази у різних зразках сироватки крові (титрування розчином NaOH).

Визначення активності ферментів, дослідження механізму їх дії та кінетики ферментативного каталізу.

Актуальність теми: Знання механізму дії ферментів та кінетики ферментативного каталізу лежить в основі розуміння метаболічних процесів у клітинах, тканинах та органах організму, що важливо для засвоєння перебігу хімічних перетворень і застосування ферментних препаратів, їх інгібіторів у практичній медицині.

Конкретні завдання:

Ø Пояснювати механізм дії ферментів на основі спорідненості ферменту до субстрату та процесів, що перебігають у фермент-субстратному комплексі.

Ø Трактувати зміни кількісного визначення активності ферментів як діагностичного показника розвитку певної патології.

Ø Пояснювати застосування інгібіторів та активаторів ферментів при порушеннях обміну речовин та певних патологіях.

Ø Аналізувати механізм дії ферментів на прикладі хімотрипсину та ацетилхолінестерази.

Ø Засвоїти методику визначення активності пептидаз і амілази слини та оцінити їх клініко-діагностичне значення.

Теоретичні питання

1. Принципи кількісного визначення активності ферментів:

· за кількістю продукту, що утворюється під дією ферменту;

· за кількістю субстрату, що використовується;

· за зміною кількості коферменту (окисно-відновні перетворення для НАД та ФАД);

· спектрофотометричні методи визначення активності ферментів

· візуалізація результатів ферментативної реакції.

2. Одиниці ферментативної активності.

3. Основні положення кінетики ферментативного каталізу:

· залежність швидкості реакції від концентрації субстрату;

· залежність швидкості реакції від концентрації ферменту;

· утворення фермент-субстратного комплексу та процес перетворення субстрату;

· рівняння Міхаеліса-Ментен;

· смислове значення величини К_m (спорідненість ферменту до субстрату).

· вираз ферментативної реакції в подвійних зворотних величинах; рівняння Лануівера-Берка.

4. Механізми дії ферментів (перетворення субстрату):

· ефекти зближення та орієнтації;

· ефекти кислотно-основного каталізу;

· ефекти нуклеофільного та електрофільного каталізу.

5. Механізми каталітичної дії хімотрипсину та ацетилхолінестерази.

Практична робота на наступне заняття (21.09.2012):

- ЗАПИСАТИ протоколи дослідів: принцип методів (коротко, що є самим головним), хід роботи (повністю);

- ВИВЧИТИ: принципи методів, які вивчаються, та клініко-діагностичне значення;

- ВМІТИ усно пояснювати отримані результати;

- ПІДГОТУВАТИСЯ до написання висновків.

Дослід 1. Провести порівняльний аналіз активності холінестерази у різних зразках сироватки крові (титрування розчином NaOH).

Принцип методу. Холінестераза каталізує реакцію гідролізу ацетилхоліну з утворенням холіну та оцтової кислоти. В крові людини міститься два види холінестерази. В сироватці міститься неспецифічна псевдохолінестераза, яка розщеплює не лише ацетилхолін, але й інші ефіри холіну.В еритроцитах міститься специфічна істинна ацетилхолінестераза, яка розщеплює лише ацетилхолін.Метод виявлення та кількісного визначення холін естерази ґрунтується на титруванні лугом оцтової кислоти, що вивільнилась в процесі гідролізу ацетилхоліну. Кількість лугу, що пішла на титрування, є мірою активності ферменту.

Хід роботи. Беруть дві пробірки. У першу відміряють 0,5 мл сироватки крові №1, у другу – 0,5 мл сироватки крові № 2. Потім у обидві пробірки з досліджуваними сироватками додають по 2 мл 2%-го розчину ацетилхоліну та інкубують при 37^◦ 10 хвилин. Після цього додають по 2 краплі фенолфталеїну і титрують вміст пробірок 0,1 М розчином NaOH до слабо рожевого забарвлення. Кількість лугу, що пішла на титрування, є мірою активності ферменту.

Заповнити таблицю:

Досліджувана сироватка	Кількість 0,1 М NaOH, що пішла на титрування; в мл	Висновок
№1
№2

За результатами проведеного експерименту зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. Визначення активності холін естерази сироватки крові використовується для діагностики ряду захворювань, зокрема інфаркту міокарда, вірусного гепатиту, злоякісних пухлин печінки, тощо. Перераховані захворювання супроводжуються значним зниженням активності холін естерази сироватки крові.

Література

Основна:

1. Біохімічний склад рідин організму та їх клініко – діагностичне значення. Довідник / За ред. Склярова О.Я. – Київ: Здоров’я, 2003. – 192 c.

2. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – 508 с.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744 с.

4. Практикум з біологічної хімії / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С. 3 – 46.

Додаткова:

1. Ангельскі С., Якубовскі З., Домінічак М. Г. Клінічна біохімія. – Сопот, 1998. – 451 с.

2. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1990. – 528 с.

3. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – Москва: Мир, 2000. – 470 с.

4. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. – Москва: Мир, 2004. – С. 63-71, 79-83.

Дата добавления: 2015-10-29