Схема реакции торможения гемагглютинации для диагностики вирусных инфекций

Компоненты, мл	Пробирки/лунки	Контроль
						сыворотки	антигена
Физиологический раствор	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Сыворотка больного в разведении 1:50	І	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	---
ІІ	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	---
Разведение сыворотки	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600	1:3200	1:100
Вирусный диагностикум	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25		0,25
Инкубация в термостате при 37°С 30 мин
2% взвесь куриных эритроцитов	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Результаты	І
ІІ

Реакция нейтрализации основана на взаимодействии специфических антител иммунной сыворотки с вирусом, что приводит к нейтрализации последнего.Реакцию можно ставить в культурах клеток с учетом результатов ЦПД, в цветной пробе, при помощи рН-метрии и феномена бляшкообразования, а также можно использовать куриный эмбрион и лабораторных животных. Данная реакция может быть использована как с целью идентификации вируса, так и с целью установления титра антител в сыворотке крови больного. Реакция часто используется при диагностике герпеса, гриппа, парагриппа, паротита, полиомиелита и др.

Р-ция нейтрализации в культуре клеток.

Компоненты реакции: вирусосодержащий материал, иммунная противовирусная сыворотка, среды для культивирования культур клеток и культура клеток в пробирках или флаконах (чаще всего используют культуры клеток HeLa, СМЦ, почек обезьян, первичные культуры клеток куриных эмбрионов и эмбрионов человека). При постановке реакции в пробирки с иммунной сывороткой вносят вирусосодержащий материал, а после инкубации при комнатной температуре на протяжении 30-60 мин добавляют однослойные клеточные культуры. Система инкубируется при 37ºС в течение недели. Учет результатов ведут по наличию ЦПД. Его отсутствие свидетельствует о нейтрализации вируса специфической иммунной сывороткой.

Цветная проба предусматривает, что при взаимодействии вирусов с культурой клеток последние гибнут, рН среды остается щелочным и цвет индикатора не изменяется. При нейтрализации вируса антителами специфической сыворотки или при отсутствии соответствующих вирусов создаются условия для развития клеток. В живых клетках активно протекает обмен веществ, вследствие чего образуются кислые продукты клеточного метаболизма, что обуславливает сдвиг рН в кислую сторону. А это в свою очередь обуславливает изменение цвета индикатора фенолрота с красного (при щелочном рН) на соломенно-желтый или оранжевый (при кислом рН).

Реакция нейтрализации бляшкообразования заключается в том, что антитела специфической иммунной сыворотки, которые нейтрализуют вирусы, способствуют уменьшению числа бляшек – зон некроза – в однослойной культуре клеток. О нейтрализующей активности сыворотке судят по уменьшению числа и величины бляшек в сравнении с контролем без специфической сыворотки. Реакция считается позитивной, если число бляшек или их величина уменьшилась на 80% по сравнению с контролем.

Реакция нейтрализации на лабораторных животных или куриных эмбрионах. Лабораторное животное или куриный эмбрион заражают смесью вируссодержащего материала и специфической иммунной сыворотки. При учете результатов учитывается количество погибших эмбрионов или животных, образование зон некроза на хориоалантоисной оболочке куриных эмбрионов или оценивают степень нейтрализации вирусов по их гемагглютинирующей активности.

Реакция связывания комплемента (РСК) часто используется в диагностике вирусных инфекций (пригодна для диагностики практически всех вирусных инфекций). К особенностям РСК при диагностике вирусных инфекций принадлежит то, что ее можно ставить как при температуре 37ºС (инкубация системы Аг-Ат-комплемент в течение часа), так и на холоде (+4ºС на протяжении 18 часов), а также использовать микрометод (все ингредиенты берутся в объеме не 0,5 мл, а 0,25 мл).

Реакция иммунодиффузии основана на способности антител и антигенов диффундировать навстречу друг другу в полужидкой среде (агаровом геле). В зоне оптимальных соотношений антигенов и антител образуются линии преципитации. Их число зависит от количества антигенов, которые отличаются своими эпитопами, т.к. каждая линия соответствует своей системе Аг-Ат. Существует более чувствительный тест – основанный на феномене иммунодиффузии в сочетании с электрофорезом – встречный иммуноэлектрофорез – чаще всего используется для выявления HbsAg вируса гепатита В или других вирусных антигенов обладающих негативным зарядом. Тест основан на способности антигенов с негативным зарядом двигаться в направлении анода, а антител сыворотки, обладающих положительным зарядом, - в направлении катода при пропускании постоянного тока.

Метод флюоресцирующих антител (МФА) или реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – используется для выявления и идентификации вирусов как в исследуемом материале, так и в предварительно зараженных культурах клеток. Принцип метода заключается во взаимодействии антигенов и антител, предварительно меченых флюорохромом (родамин – дает красное свечение или флюоресцеинизотиоционат натрия – дает зеленое свечение в УФ-лучах).При непрямом методе (реакция непрямой иммунофлюоресценции -РНИФ) – однослойную культуру клеток на предметном стекле заражают исследуемым вирусосодержащим материалом и инкубируют несколько дней. После этого стекла фиксируют в ацетоне и наносят специфическую сыворотку, инкубируют во влажной камере, отмывают от излишков сыворотки и наносят тонкий слой флуоресцирующей антисыворотки, затем отмывают, подсушивают и исследуют под люминисцентным микроскопом, наблюдая характерное свечение.

Реакция пассивной (обратной) непрямой гемагглютинации (РПНГ) используется для выявления вирусных антигенов в исследуемом материале. Суть ее состоит в том, что эритроциты человека и животных, нагруженные специфическими противовирусными антителами, способны взаимодействовать с вирусными антигенами, вследствие чего склеиваются и выпадают в осадок. Компоненты реакции: эритроциты, обработанные таниновой кислотой с адсорбированными на них молекулами антител (сенсибилизированные эритроциты), вирусные антигены и раствор электролита. Реакция ставится в пробирках, лунках, на стекле, в капиллярах, микрометодом. При положительной реакции наблюдается выраженная агглютинация эритроцитов с образованием осадка с неровным волнистым краем, который равномерно распределяется по дну пробирки или лунки – “перевернутый зонтик”. При отрицательном- плотный, компактный осанок с ровным краем – “пуговичка”.

Кроме перечисленных реакций в настоящее время широко используют РИА (радиоиммунный анализ), ИФА (иммуноферментный анализ), вестерн-блот, ПЦР (полимеразная цепная реакция), метод гибридизации нуклеиновых кислот, ИЭМ (иммунная электронная микроскопия) и др.

Особенность серологических исследований при вирусных инфекций – исследование парных сывороток. Первую сыворотку берут у больного в острый период в начале болезни, хранят при t = 4-8ºC или в замороженном состоянии при -20ºС, а вторую – через 10-14 дней. Сыворотки исследуют одномоментно! О болезни свидетельствует сероконверсия, т.е. нарастание титра антител во второй сыворотке по сравнению с первой (диагностическое значение имеет сероконверсия в 4 раза и выше).

Дата добавления: 2015-10-29